[發明專利]大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因及其克隆方法和應用

在審

• 申請號: 202010040262.6
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111139254A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 李海燕;劉偉燦;李曉薇;王法微;周永剛;王南;董園園
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

1.大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因，其特征在于，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區發生定向單氨基酸置換和雙氨基酸置換后獲得的基因；所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守區發生定向單氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS1(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守區發生定向雙氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS1(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區發生定向單氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS2(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.5所示，所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區發生定向雙氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS2(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根據權利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因為大豆吉育72中兩個編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。

3.根據權利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據權利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因與Glyma.01G139600同源性為100％，所述大豆GmEPSPS2基因與Glyma.03G027400同源性為99％，與Glyma.03G027400存在10個核苷酸差異。

5.如權利要求1至4中任意一項所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、設計基因克隆引物，利用PCR技術從大豆吉育72幼苗的葉片中擴增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因；

步驟二、利用Overlap-PCR技術，采用Overlap-PCR定向突變引物，通過三次PCR，分別擴增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因編碼蛋白單氨基酸置換和雙氨基酸置換后的mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因。

6.根據權利要求5所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因的克隆方法，其特征在于，步驟一中，所述基因克隆引物見下表。

7.根據權利要求5所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因的克隆方法，其特征在于，步驟二中，所述Overlap-PCR定向突變引物見下表。

8.如權利要求1至4中任意一項所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因在提高大豆草甘膦抗性能力中的應用。