[發明專利]一種黃曲霉毒素降解菌的高效發酵方法

有效

• 申請號: 202010038988.6
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111154679B
• 公開（公告）日: 2021-08-06
• 發明（設計）人: 周文文;韋顯雪;王樹雯;錢超
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23L5/20;C12R1/07
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明公開了一種黃曲霉毒素降解菌的高效發酵方法，屬于生物技術領域，包括種子液制備、發酵培養、添加攜氧劑、測定黃曲霉毒素含量等步驟；利用本發明提供的在黃曲霉毒素降解菌的發酵體系中添加十二烷作為攜氧劑的方法，能夠提高目標菌種發酵效率，得到的目標菌種的發酵產物能顯著的降低黃曲霉毒素的殘留率，發酵20h的上清液降解黃曲霉毒素后的毒素殘留率相比不加攜氧劑的空白對照組降低了24.41％，毒素殘留率僅為9.6％。

技術領域

本發明屬于(涉及)微生物技術領域，特別涉及到一種添加攜氧劑的黃曲霉毒素降解菌的高效發酵方法。

背景技術

黃曲霉毒素(aflatoxins)是一類含有二氫呋喃環結構的次級代謝產物，是一類毒性極強的天然毒素。其產生主要是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等在一定的環境條件下生物合成的。黃曲霉毒素對人類有強毒性和高致癌性，廣泛的分布在霉變的谷物及堅果(包括大米、玉米、花生、棉籽等)、被污染的乳及乳制品中。目前已發現的黃曲霉毒素共有18種，其中最常見的黃曲霉毒素主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1及G2，其中，黃曲霉毒素B1是目前已知的含量最多、致癌效率最高的天然致癌物質。國際癌癥研究機構(IARC)將黃曲霉毒素列為一類致癌物。黃曲霉毒素具有較強的耐熱性，其中黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃，而黃曲霉毒素被加熱到280℃才開始被裂解破壞，在食品加工過程中含量幾乎不會減少，所以黃曲霉毒素能被保留在整條食物鏈中而不會被普通加工流程除去。因此，被污染的農產品等食品生產原料內聚集的黃曲霉毒素是人類極大的健康威脅。

如何去除黃曲霉毒素一直是一個棘手的問題，目前常規的手段有物理去除法、化學去除法和生物去除法。這些方法在實驗室環境下都有較好的效果，但在應用中都因為成本、方法特性等原因不能廣泛的應用，存在一定的局限性。

目前生物酶解法是黃曲霉毒素降解的最新研究方向，采用培養菌株提取活性物質來分解黃曲霉毒素擺脫了以往傳統方法的限制，有著大規模生產成本低、解毒物質幾乎無毒性、且應用限制小，是化學和物理降解黃曲霉毒素方法的有競爭性的替代，具有良好的應用前景和研究價值。阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)DT也是這樣一種能分解黃曲霉毒素的菌株。該菌種是從杭州(E120°12’，N30°16’)地區的園地、垃圾焚燒站等地收集的植物樣品中分離篩選出的，對黃曲霉毒素有降解作用的一種野生菌，目前研究該菌種在LB培養基內37℃、搖床上180rpm培養24h的發酵上清液取900μL與100μL、濃度為20μg/mL的黃曲霉毒素甲醇溶液在37℃避光消解72h，黃曲霉毒素的降解率可達78％。

對于需氧微生物來說，發酵體系內的溶氧水平是微生物生長繁殖的限制性底物。氧氣在水中的溶解度較差，因此采用多種方法增大氧氣在水中的溶解度，改善供氧條件能很好的提高菌種生長速率，達到提高胞內外產物產量的目的。傳統的增加通氣量的方式包括增大攪拌速率、增大通氣量等，但這些方式無疑都會增大能源消耗，在實際生產應用中會增加生產成本。氧氣在水中的溶解度較差，但在一些碳氫化合物和碳氟化合物中溶解度較好，例如正十六烷、十二烷、全氟化碳等。通過向培養液中添加一定量的碳氫化合物并通過搖床搖動等方法使這些碳氫化合物在氣-液分界面來回穿梭能提高菌種的供氧量，加快菌的生長速度，提高胞內外物質產量。Adam W.Westbrook等人研究了氧載體在工程枯草芽孢桿菌異源產生HA中的應用。初步篩選的七種潛在氧載體中，其中在含有正庚烷、正十六烷、全氟甲基萘烷和全氟-1,3-二甲基環己烷的培養物中觀察到HA滴度和/或細胞密度的顯著改善。對載體濃度、載體添加時間和攪拌速率進行進一步調整，導致培養結果進一步改善，在僅培養10小時后HA滴度就達到4.5g/L。王爽等人使用6％的二甲基硅油、大豆油、橄欖油及表面活性劑吐溫-80分別作為攜氧劑添加到發酵初期的納他霉素發酵液中，使納他霉素的產量提高了50％以上，添加表面活性劑吐溫-80使產量提高了82％。因此，探究黃曲霉毒素降解菌對氧氣的依賴情況，通過改善供氧條件以達到提高菌種發酵效率，最終增強黃曲霉毒素降解能力就成為了可能。

發明內容