[發明專利]固定化酶、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 202010038661.9
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111117996A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;肖毅;羅杰斯卡·維亞撒·威廉姆斯;崔瑜霞;張娜;趙佳東;高妍妍
• 申請（專利權）人: 吉林凱萊英醫藥化學有限公司
• 主分類號: C12N11/098
• 分類號: C12N11/098
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 梁文惠

本發明公開了一種固定化酶、其制備方法及應用。其中，該制備方法包括以下步驟：采用聚乙二醇修飾交聯劑，得到聚乙二醇修飾的交聯劑；將游離的酶沉淀，然后加入聚乙二醇修飾的交聯劑進行交聯固定得到固定化酶。應用本發明的技術方案，采用聚乙二醇修飾的交聯劑對酶進行固定，固定后作為無載體固定化酶具有更好的穩定結構，具有更強的機械穩定性。

技術領域

本發明涉及生物催化技術領域，具體而言，涉及一種固定化酶、其制備方法及應用。

背景技術

生物催化已經成為重要藥物部分、結構單元和中間體的綠色合成最有前景和最有利的技術之一，特別是為手性合成提供了獨特的替代途徑。合成化學家對連續流合成的興趣日益增加，現在引起了對生物轉化的關注。在工業過程中越來越多地使用酶作為催化劑導致對固定化形式的酶的需求增加，因為它提供了獨特的工藝和成本優勢。通常稱為“生物催化劑”的固定化酶廣泛用于工業有機合成和生物轉化。

生物催化劑可以使用全活細胞、死細胞、粗酶或純化酶來生產，這取決于酶的類型和應用。酶的可擴大生產和蛋白質工程的進步使得生物催化劑有可能實現商業化應用，并且具有較好的經濟價值。

新型固定化平臺的出現使得固定化酶在連續流動生物催化中完美整合。新型高效酶的發現和進化、強調生物催化的新型反向合成方法、降低的重組蛋白成本和酶固定化策略等都是生物催化在連續合成中應用的良好基礎。

從概念上講，制備固定化酶所用的固定主要包括物理吸附、載體結合、包埋和交聯等方法。其中，物理吸附依賴于酶與載體的親和力，雖然簡單，但相互作用很弱，酶很容易被解吸和丟失；載體結合涉及通過離子鍵或共價鍵將酶連接到水不溶性載體上，該方法具有由于強化學鍵而使酶分子部分失活的缺點，目標酶也需要更純化的形式，這最終增加了催化劑生產的成本。

近年來，在各種固定技術中，無載體，自交聯酶固定化變得越來越重要。在過去的幾十年中，無載體交聯酶技術成為增強酶穩定性的有吸引力的方法[Roy et al，2004]。在該技術中，酶通過雙功能交聯劑交聯，形成穩定的多相生物催化劑，明顯優于常規固定化酶。通常使用各種載體的固定化酶是“載體結合的生物催化劑”，并且大部分非催化載體(總質量的約90～99％)的存在導致其體積活性的稀釋。而被稱為“無載體生物催化劑”的交聯酶每單位體積表現出非常高的催化活性，從而使體積生產率和時空產率最大化[Sheldon等2005]。

目前，有關于固定脂肪酶、青霉素酰基轉移酶、蛋白酶及氨基酰化酶等的無載體方法的已有報道，但是在其他敏感酶或新出現的酶如單加氧酶、氨裂解酶、烯還原酶、亞胺還原酶、轉氨酶、酮還原酶、氨基酸脫氫酶及腈水解酶等制作成固定化酶的應用幾乎沒有報道。

另外，目前無載體固定化酶的缺點包括：在沒有固體支持的情況下，無載體固定化酶尚不能完全擴展到大批量生產，因為它們對剪切應力和苛刻的攪拌條件表現出低機械穩定性，并且還可能引起過濾問題。當在分批攪拌反應中進行生物轉化時，STY(空間-時間產率)相當低，這將導致相對低的生產率，而連續流動反應可以顯著改善STY，從而得到更高的生產率、可控性及環境友好性。

因此，繼續開發一種具有較強機械穩定性的無載體固定化酶。

發明內容

本發明旨在提供一種固定化酶、其制備方法及應用，以提高固定化酶的機械穩定性。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種固定化酶的制備方法。該制備方法包括以下步驟：采用聚乙二醇修飾交聯劑，得到聚乙二醇修飾的交聯劑；將游離的酶共沉淀，同時加入聚乙二醇修飾的交聯劑進行交聯固定得到固定化酶。

進一步地，采用聚乙二醇修飾交聯劑的步驟包括：交聯劑與聚乙二醇混合，得到聚乙二醇修飾的交聯劑；優選的，聚乙二醇為PEG 2000～PEG 6000；優選的，聚乙二醇與所以交聯劑的質量比為1:5～5:1，更有選的，質量比為1:2～3:1；優選的，交聯劑為戊二醛或醛基化右旋糖苷；優選的，在室溫下混合3～20小時。