[發明專利]一種微環境敏感型熒光探針的制備方法及其對HSA/BSA檢測的應用

在審

• 申請號: 202010037437.8
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111187247A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 張彩紅;亢娜;姚慶佳;王文;張國梅;董川;雙少敏
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C07D311/94
• 分類號: C07D311/94;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

本發明屬蛋白檢測的熒光探針技術領域，提供一種微環境敏感型熒光探針及其制備方法和對HSA/BSA檢測的應用。該熒光探針分子式為C₃₁H₂₃NO₂。制備方法為：水楊醛、2?環戊烯?1?酮、咪唑在氮氣的保護下得化合物1。化合物1和4?二苯氨基苯甲醛反應得分子探針。探針對微環境極其敏感，隨著溶劑極性和粘度的變化，熒光光譜有明顯的改變。探針在PBS:DMF=8:2的溶劑體系中，探針和HSA/BSA作用，發射波長藍移且熒光增強，利用熒光強度的變化可檢測HSA/BSA的濃度，并用于HSA/BSA的細胞成像。本發明熒光探針合成簡單，對微環境敏感，對HSA/BSA檢測選擇性好，靈敏度高，線性范圍寬。

技術領域

本發明屬于蛋白檢測的熒光探針技術領域，具體涉及一種微環境敏感型熒光探針及其制備方法和對HSA/BSA檢測的應用。

背景技術

人血清蛋白（HSA）與牛血清蛋白（BSA）是同源蛋白，在結構與氨基酸序列上有著很高的相似性，都含有半胱氨酸殘基。HSA作為人體血漿中含量最豐富的一種蛋白質，可以參與酶催化活動、維持血漿滲透壓、參與免疫調節、以及運輸藥物分子。其含量的異常，可以作為腎功能損害和相關腎臟疾病的早期預警。BSA，作為酶的穩定劑，可以防止酶的分解和非特異性吸附，減輕有些不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性。在當前疫苗生產中普遍采用牛血清作為細胞培養的主要成分，這導致疫苗中不同程度地殘留BSA，BSA于機體來說是一種異源蛋白，如果殘留過多，注射疫苗后就可能引起過敏性休克等不良反應。因此，發展高效、準確、快速檢測HSA和BSA的方法是非常重要的。

近年來，熒光探針因具有響應速度快、靈敏度高、操作簡單，實時監測等優點受到了極大關注，可用于蛋白質檢測。

發明內容

本發明旨在提供一種微環境敏感型熒光探針及其制備方法和對HSA/BSA檢測的應用，該熒光探針為新型有機小分子熒光探針，對HSA/BSA的響應具有高選擇性、高靈敏度和響應快等特性，并能用于細胞中HSA/BSA的檢測。本發明利用蛋白質結構的微環境，結合巰基反應位點，設計合成能用于細胞中檢測HSA/BSA的熒光探針。

本發明由如下技術方案實現的：一種微環境敏感型熒光探針，該熒光探針的分子式為C₃₁H₂₃NO₂，結構式如下：。

制備所述的微環境敏感性熒光探針的方法，具體步驟如下：

（1）在H₂O/THF的混合溶劑中，加入水楊醛，2-環戊烯-1-酮和咪唑，將混合物在室溫下氮氣保護攪拌12~14 h；所得反應液用二氯甲烷萃取三次，飽和食鹽水洗滌兩次，無水Na₂SO₄干燥，減壓除去溶劑，并通過柱色譜法純化產物，得到黃色固體化合物1，其結構式為：；其中柱色譜法中所用溶劑為二氯甲烷/石油醚=5 /1，v/v；

（2）化合物1、對二苯氨基苯甲醛和哌啶溶于乙醇中，回流24~26 h，反應后混合溶液中加入水，用二氯甲烷萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌兩次，無水Na₂SO₄干燥，減壓除去溶劑，硅膠柱二氯甲烷/甲醇=500/1，v /v分離純化，真空干燥得到紅色固體化合物2即為微環境敏感性HAS/BSA熒光探針分子。

步驟（1）中混合反應溶劑中H₂O和THF的體積比為1：1，每1 mmol水楊醛使用溶劑1mL；每1ml的反應混合液加1ml的水，水楊醛：2-環戊烯-1-酮：咪唑的摩爾比為1：1~1.2：1~1.2。

步驟（2）中化合物1、對二苯氨基苯甲醛、哌啶的摩爾比為1：0.8~1：0.2。

所述的微環境敏感型HSA/BSA熒光探針的應用，該熒光探針應用于PBS：DMF = 8 :2的體系和細胞組織環境中HSA和BSA的檢測。