[發明專利]犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒及制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010036895.X
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111197100B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 劉群;楊聰山;劉晶;許建海
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

1.一種犬新孢子蟲的特異基因序列，其特征在于，所述特異基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一對擴增引物，所述擴增引物用于擴增權利要求1所述的犬新孢子蟲的特異基因序列，其特征在于，所述擴增引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：

上游引物： 5’-CGCACAAGAAACCGAGGAA-3’（SEQ ID NO.2），

下游引物：5’-GAAGGCGAGAAGCCCAAGT-3’（SEQ ID NO.3）。

3.一種犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求2所述的擴增引物。

4.如權利要求3所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒，其特征在于，還包括以下試劑：10×PCR反應液、陽性對照DNA、陰性對照、和ddH₂O。

5.如權利要求4所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照DNA為犬新孢子蟲基因組DNA。

6.如權利要求4所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為dH₂O。

7.權利要求4所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下操作：

10×PCR反應液的制備：300mM的dNTPs20μL，Tris2.42mg，KCl7.45mg，MgCl₂ 0.258mg，200 U 的Taq酶20μL，加入150μL ddH₂O，用HCl調pH至8.5，用ddH₂O定容至200μL；

陽性對照DNA的制備：陽性對照DNA為犬新孢子蟲基因組DNA，將培養的犬新孢子蟲用細胞計數板計數，將10⁷個犬新孢子蟲提取基因組DNA，然后稀釋為100μL；

試劑盒的組裝：按下列內容組裝試劑盒：

10×PCR反應液:200μL，

10mM上游引物: 50μL；

10mM下游引物: 50μL；

陽性對照DNA: 100μL；

ddH₂O: 2mL；

其中，整個操作過程要求在無菌環境下進行。

8.權利要求4所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒的非疾病診斷和治療目的的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

待檢樣品DNA的提取：將待檢樣品提取DNA；

PCR反應體系的準備：準備待檢樣品數+2的PCR反應管，每個PCR反應管均做好標記并根據標記按照PCR反應體系添加相應試劑；

PCR擴增：將上述PCR反應管置于PCR儀中進行PCR擴增，其中PCR的反應條件為：94℃預變性4min、94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s, 共34個循環，后72℃延伸5min；以及

PCR產物觀察：將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，之后在紫外燈下觀察擴增結果，如果出現376bp擴增條帶為陽性結果，不出現則為陰性結果；

其中，所述PCR反應體系包括：10×PCR反應液：2μL；待檢樣品DNA或陽性對照或陰性對照；10mM上游引物：1μL；10mM下游引物：1μL；ddH₂O：補足至20μL。

9.如權利要求8所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒的非疾病診斷和治療目的的使用方法，其特征在于，所述待檢樣品DNA的用量根據提取基因組DNA濃度決定，所述陽性對照和所述陰性對照的用量均為1μL。

10.權利要求4所述的犬新孢子蟲特異PCR檢測試劑盒在非疾病診斷和治療目的的動物檢驗檢疫領域中的應用。