[發(fā)明專利]一種高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有強(qiáng)殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞的方法

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• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111349601A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪曉敏;袁衛(wèi)平;楊爽;袁勝男;初雅婧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 天津市尚儀知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12217
• 代理人: 王山

本發(fā)明公開了一種高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有強(qiáng)殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞的方法，包括構(gòu)建過表達(dá)4?1BBL的K562細(xì)胞；構(gòu)建過表達(dá)IL?15的K562細(xì)胞；利用銫照射源照射細(xì)胞至細(xì)胞處于滅活狀態(tài)；無菌條件下取健康人靜脈血，離心收集外周血中的單個核細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；取外周血單個核細(xì)胞與滅活的K562細(xì)胞、滅活的過表達(dá)4?1BBL的K562細(xì)胞、滅活的過表達(dá)IL?15的K562細(xì)胞共培養(yǎng)；利用CD56磁珠富集NK細(xì)胞。本發(fā)明方法操作簡單，獲得富含高殺傷活性的NK細(xì)胞群體，不含雜質(zhì)細(xì)胞，避免了雜質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的免疫原性，臨床應(yīng)用副作用較小，適宜腫瘤患者的輔助治療。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有強(qiáng)殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

綜合治療是惡性腫瘤的重要治療原則,除傳統(tǒng)的化療、放療及手術(shù)等治療方法外,免疫治療的地位日益增強(qiáng)。自20世紀(jì)80年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)淋巴因子激活的自體殺傷細(xì)胞(lymphokine activated killer,LAK)經(jīng)大劑量IL-2體外擴(kuò)增后,可治療惡性腫瘤,由此提出了過繼性免疫細(xì)胞治療腫瘤的概念。腫瘤免疫過繼治療中，NK細(xì)胞是重要的效應(yīng)細(xì)胞，NK細(xì)胞因不需活化即具有細(xì)胞毒作用,且抗瘤譜較廣而被廣泛研究，體外實驗證實NK細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。然而由于NK細(xì)胞的殺傷活性與IL-2的劑量高低、體內(nèi)活化NK的數(shù)量及腫瘤表面MHC-I類抗原的表達(dá)高低有關(guān),致使NK細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的療效不一，NK細(xì)胞殺傷活性對于腫瘤細(xì)胞的根除至關(guān)重要。研究表明,NK細(xì)胞表面有抑制性受體及活化性受體,通過調(diào)節(jié)其受體的表達(dá)可影響NK細(xì)胞的殺傷活性。因此,如何提高NK細(xì)胞的殺傷活性,提高NK細(xì)胞對表達(dá)MHC-I類抗原的腫瘤細(xì)胞的識別,成為解決過繼免疫治療效果的關(guān)鍵問題。

目前尚未有真正簡單高效的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，這制約著NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用。因此，對NK細(xì)胞的生物學(xué)特性及體外擴(kuò)增的進(jìn)一步研究，必將對惡性腫瘤的臨床免疫過繼治療產(chǎn)生巨大的推動作用。NK細(xì)胞由于無需抗原預(yù)先致敏即可直接殺傷靶細(xì)胞,且不具有“MHC限制性”,而腫瘤細(xì)胞往往缺乏MHC-I類分子的有效表達(dá),故NK細(xì)胞是腫瘤免疫治療中的一個重要部分。除了NK細(xì)胞獲得性免疫治療,增強(qiáng)NK細(xì)胞活性和探索NK細(xì)胞介導(dǎo)的間接或直接抗腫瘤免疫聯(lián)合治療是未來NK細(xì)胞腫瘤免疫治療的研究方向。目前,增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的策略可以是通過細(xì)胞因子、多功能抗體介導(dǎo)NK細(xì)胞活性,通過調(diào)節(jié)抑制性信號和活化性信號傳遞促進(jìn)NK活化,或通過免疫藥物及基因修飾提高NK細(xì)胞功能等。

盡管近年來NK細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增取得了較大進(jìn)展，已有的擴(kuò)增方案仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化，并通過大量體內(nèi)、體外的試驗對新的擴(kuò)增方案進(jìn)行評估.與傳統(tǒng)使用IL-2短期培養(yǎng)NK細(xì)胞不同，大規(guī)模長期擴(kuò)增NK細(xì)胞所需的硬件設(shè)施和軟件管理需要符合現(xiàn)行的藥品生產(chǎn)質(zhì)量規(guī)范(good manufacturingpractice，GMP)，培養(yǎng)的細(xì)胞需要經(jīng)過嚴(yán)格的細(xì)菌和真菌水平檢驗，以控制NK細(xì)胞產(chǎn)品的安全。在NK細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤患者之前，還需要檢測NK細(xì)胞受體和殺傷功能的變化。目前NK細(xì)胞免疫治療面臨的挑戰(zhàn)還包括:如何增強(qiáng)體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞對腫瘤的識別和浸潤，如何提高NK細(xì)胞在體內(nèi)的存活率。仍需要進(jìn)一步研究更新的擴(kuò)增方案，提高擴(kuò)增NK細(xì)胞的數(shù)量和功能，為NK細(xì)胞免疫治療清除最終的障礙。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明就是為了解決上述技術(shù)問題，所提供了一種高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有強(qiáng)殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞的方法，具體的是一種利用X-Ray滅活的過表達(dá)4-1BBL和/或IL-15的K562細(xì)胞體刺激外周血NK細(xì)胞擴(kuò)增的方法。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種高效體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有強(qiáng)殺傷力的自然殺傷性細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

a.載體構(gòu)建：構(gòu)建過表達(dá)4-1BBL和IL-15的載體；

b.病毒包裝：采用步驟a中構(gòu)建的質(zhì)粒包裝慢病毒，檢測病毒滴度；