[發明專利]NK細胞擴增方法

有效

• 申請號: 202010036412.6
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111154721B
• 公開（公告）日: 2023-10-17
• 發明（設計）人: 賀光銳;苑英姿;王慧琴
• 申請（專利權）人: 深圳格泰賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京云嘉湃富知識產權代理有限公司 11678
• 代理人: 陳順華

本發明提供一種高效的NK細胞擴增方法，該擴增方法包括以下步驟：(1)分離獲得單個核細胞；(2)加入無血清培養基和活化因子，培養；其中，活化因子為IL?2和CD3單抗。本發明實施例所提供的NK細胞擴增方法在單個核細胞分離出來后直接進行體外擴增，選用特定的活化因子的組合，從而實現極為高效的NK細胞擴增，擴增倍數可達到3000倍以上，相比于現有的擴增方法提升了一個數量級，具有非常好的擴增效果，操作簡單。

技術領域

本發明涉及NK細胞培養技術領域，尤其是涉及一種NK細胞擴增方法。

背景技術

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是無T和B細胞特征表面特征的第三類淋巴細胞中最主要的一種，是連接先天性和特異性免疫系統的橋梁。正常情況下，機體內NK細胞大多在外周血中循環，并以未活化狀態存在。NK細胞可在未經致敏情況下，快速殺滅惡變細胞和病毒感染細胞，展現出特殊的免疫調節功能和細胞毒功能。但是NK細胞在體內外周血液中所占比例很少，一般不超過淋巴細胞總數的10％，在短期內要獲得大量高純度的NK細胞比較困難。

為此，研究人員嘗試通過體外擴增的方式獲得NK細胞。其中最常用的是通過飼養細胞的方法來培養外周血單個核細胞中的NK細胞，這種方法雖然能夠獲得大量的NK細胞，但人源細胞的引入可能會帶來一定的安全隱患。另有一些使用的比較廣泛的方法，例如通過細胞因子來刺激NK細胞的擴增。但現有的細胞因子組合刺激NK細胞擴增的方法所提升的擴增倍數較小，一般在一兩百倍左右，難以滿足臨床上對NK細胞的需求。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種高效的NK細胞擴增方法。

第一方面，本發明的一個實施例提供了一種NK細胞擴增方法，該擴增方法包括以下步驟：

(1)分離獲得單個核細胞；

(2)加入無血清培養基和活化因子，培養；

其中，活化因子為IL-2(白細胞介素-2)和CD3單抗。

本發明實施例的NK細胞擴增方法至少具有如下有益效果：

本方案在單個核細胞分離出來后直接進行體外擴增，選用特定的活化因子的組合，實現了極為高效的NK細胞擴增，擴增倍數可達到3000倍以上，相比于現有的擴增方法提升了一個數量級，具有非常好的擴增效果，同時操作簡單、成本低廉。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，IL-2的終濃度為300～800IU/mL，CD3單抗的終濃度為4～20ng/mL。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，基于無血清培養基的總體積，單個核細胞的細胞密度為0.5×10⁶～1.0×10⁶/mL。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，培養第5天全換液。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，全換液后，培養基內IL-2的終濃度為300～800IU/mL。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，全換液包括以下步驟：

在第5天離心、去上清后，加入緩沖液混勻，離心，保留沉淀；

將沉淀重懸于無血清培養基，繼續培養。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，全換液后，每隔1～2天補加無血清培養基和終濃度為300～800IU/ml的IL-2。

根據本發明的一些實施例的NK細胞擴增方法，無血清培養基中包括1～5％體積比的自體血漿。由于現有的培養基中基本添加了人血清白蛋白，通過額外添加1～5％的自體血漿可以增加NK細胞的擴增倍數。