[發(fā)明專利]單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速恒溫檢測(cè)方法、引物組及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010036143.3
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN111020010B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉偉;李雪玲;李園園;賈犇;韋朝春;陸長德;李亦學(xué);曹永梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院;上海旺旺食品集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發(fā)明公開了一種針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速恒溫檢測(cè)方法、引物組及試劑盒。所述方法為：從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測(cè)樣品中是否存在單核細(xì)胞增生李斯特菌。本發(fā)明檢測(cè)方法具有高靈敏度和高特異性，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應(yīng)用前景。

本申請(qǐng)是2016年8月30日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?01610767426.9、發(fā)明名稱為：“快速恒溫檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法、引物及試劑盒”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)；該母案申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2015年9月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?01510556917.4、發(fā)明名稱為“快速恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes)是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陽性短桿菌，在肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品和蔬菜中均可能存在。它能引起人類和動(dòng)物李斯特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，特別對(duì)孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人危害嚴(yán)重。1986年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一；2000年，WHO又將其列為需要重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的食源性致病菌之一。

目前，國內(nèi)外對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)主要還是培養(yǎng)法和血清學(xué)的檢測(cè)方法，包括富集、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定。這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有勞動(dòng)強(qiáng)度高、耗時(shí)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。更重要的是，傳統(tǒng)方法檢測(cè)靈敏度較低、特異性不足，尤其對(duì)于來源相近的菌株，傳統(tǒng)方法很難加以區(qū)分。因此，為了確保食品安全，急需快速、簡單、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻(xiàn)Notomi?T,OkayamaH,Masubuchi?H,Yonekawa?T,Watanabe?K,Amino?N,Hase?T.Loop-mediated?isothermalamplification?of?DNA,Nucleic?Acids?Research,2000Jun?15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。