[發明專利]假結核耶爾森氏菌的核酸快速恒溫檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202010036128.9
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111020046A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 李園園;李雪玲;劉偉;韋朝春;賈犇;陸長德;李亦學;曹永梅
• 申請（專利權）人: 上海產業技術研究院;上海旺旺食品集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對假結核耶爾森氏菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增假結核耶爾森氏菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在假結核耶爾森氏菌。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610780457.8、發明名稱為：“快速恒溫檢測假結核耶爾森氏菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測假結核耶爾森氏菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術

假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)屬于腸桿菌科耶爾森氏菌屬，是一種人畜共患的腸道病原菌，該菌可在低溫環境下生存，因此冰箱儲存食物是現代社會發生該菌感染的一個重要傳染源，可引起胃腸道癥狀、腸系膜淋巴結炎等。該菌感染在人群中以散發為主，偶爾也會引起不同規模的暴發。由于其臨床癥狀不典型，極易造成診斷不明甚至誤診而延誤治療。因此，對于該菌的預防和檢測非常重要。

傳統假結核耶爾森氏菌檢測方法由于檢測周期較長，操作相對復雜，檢測效率較低，難以滿足現代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測技術的發展，研究人員也開發出了PCR等檢測手段，但是該方法需要專門的檢測儀器，因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的假結核耶爾森氏菌。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。