[發(fā)明專利]假結(jié)核耶爾森氏菌的核酸快速恒溫檢測方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010036128.9
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN111020046A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李園園;李雪玲;劉偉;韋朝春;賈犇;陸長德;李亦學(xué);曹永梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院;上海旺旺食品集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種針對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌的快速恒溫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從待測樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增假結(jié)核耶爾森氏菌基因組特異性堿基序列的引物組作為引物，在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

(3)通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在假結(jié)核耶爾森氏菌；

其中，所述假結(jié)核耶爾森氏菌基因組特異性堿基序列為GI號(hào)為153946813的假結(jié)核耶爾森氏菌基因組的768567～768785bp位序列；

所述能擴(kuò)增假結(jié)核耶爾森氏菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物組B或引物組B’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GAATTGCTGGAAATGGTTG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GCGGATAACTCCTGTTCT-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GTAACGCTGAAATACCGAACTGTATGAAGGTGGTTTGAAACG-3’(SEQ IDNO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-CACCTTTATCTCTGATAATTTCCGCCTTTCCAGCTCATGTTGAT-3’(SEQ IDNO：8)；

引物組B’：

上游外引物F3_B：5’-GAATTGCTGGAAATGGTTG-3’；

下游外引物B3_B：5’-GCGGATAACTCCTGTTCT-3’；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GTAACGCTGAAATACCGAACTGTATGAAGGTGGTTTGAAACG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-CACCTTTATCTCTGATAATTTCCGCCTTTCCAGCTCATGTTGAT-3’；

上游環(huán)引物L(fēng)F_B：5’-GGGATTTCAATATGCTCATCCAG-3’(SEQ ID NO：11)；

和/或，下游環(huán)引物L(fēng)B_B：5’-TGATGGCGATGGGGAAAATT-3’(SEQ ID NO：12)。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述酶反應(yīng)體系包括：1×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜堿，包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF和/或LB引物。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋孩?0～65℃孵育10～90min；②80℃終止反應(yīng)2～20min。