[發明專利]單核細胞增生李斯特菌核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010035795.5
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111041114B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 劉偉;李雪玲;李園園;賈犇;韋朝春;陸長德;李亦學;曹永梅
• 申請（專利權）人: 上海產業技術研究院;上海旺旺食品集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對單核細胞增生李斯特菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增單核細胞增生李斯特菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在單核細胞增生李斯特菌。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610767426.9、發明名稱為：“快速恒溫檢測單核細胞增生李斯特菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測單核細胞增生李斯特菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陽性短桿菌，在肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品和蔬菜中均可能存在。它能引起人類和動物李斯特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多，特別對孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人危害嚴重。1986年，世界衛生組織(WHO)將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一；2000年，WHO又將其列為需要重點監測的食源性致病菌之一。

目前，國內外對于單核細胞增生李斯特菌的檢測主要還是培養法和血清學的檢測方法，包括富集、選擇性培養、生化鑒定。這些傳統檢測方法具有勞動強度高、耗時、費用高等缺點。更重要的是，傳統方法檢測靈敏度較低、特異性不足，尤其對于來源相近的菌株，傳統方法很難加以區分。因此，為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的單核細胞增生李斯特菌。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。