[發明專利]單核細胞增生李斯特菌核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010035795.5
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111041114B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 劉偉;李雪玲;李園園;賈犇;韋朝春;陸長德;李亦學;曹永梅
• 申請（專利權）人: 上海產業技術研究院;上海旺旺食品集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種非診斷目的的針對單核細胞增生李斯特菌的快速恒溫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)從待測樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴增單核細胞增生李斯特菌基因組特異性堿基序列的引物組作為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；

(3)通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在單核細胞增生李斯特菌；

其中，所述單核細胞增生李斯特菌基因組特異性堿基序列為GI號為16802048的單核細胞增生李斯特菌基因組的2418389～2418620bp位序列；

所述能擴增單核細胞增生李斯特菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物組B或引物組B’；

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-GCTTTGAAAATCGGGGTA-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’(SEQ ID NO：6)；

上游內引物FIP_B：5’-ACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內引物BIP_B：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’(SEQ IDNO：8)；

引物組B’：

上游外引物F3_B：5’-GCTTTGAAAATCGGGGTA-3’；

下游外引物B3_B：5’-GGGGAATCAAAACAGAATCC-3’；

上游內引物FIP_B：5’-ACGCAGAAGCATTAGTCACCGCCCGAACTTGATTCAAT-3’；

下游內引物BIP_B：5’-ATGCACTTCGATGATGTTCACTGGCTTACAGGATTAACTCAAC-3’；上游環引物LF_B：5’-GCGCATTCAGATATTCAATTGGC-3’(SEQ ID NO：11)。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述酶反應體系包括：1×BstDNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP_B和BIP_B引物，0.15-0.3μmol/L的F3_B和B3_B引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜堿，包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF_B引物。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增反應的反應程序為：①60～65℃孵育10～90min；②80℃終止反應2～20min。