[發明專利]采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法

在審

• 申請號: 202010035541.3
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111197067A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 潘厚軍;石存斌;常藕琴;張德鋒;任燕;王亞軍;謝駿;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N33/50
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 涂柳曉

本發明公開了一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，S1、對嗜熱四膜蟲進行培養；S2、對嗜熱四膜蟲生長曲線的測定；S3、中草藥水煮液或中藥單體試液的制備；S4、通過藥物對嗜熱四膜蟲進行培養暴露；S5、藥物暴露處理的嗜熱四膜蟲試液，進行細胞計數，分析藥物抑制嗜熱四膜蟲生長的半數抑制濃度；S6、CCK?8法測定細胞活力隨藥物濃度的變化，用SPSS軟件計算CC50；S7、評估中草藥對嗜熱四膜蟲的抑制殺滅效果；S8、設計藥物濃度，添加入飼料中，評估魚類對寄生蟲的作用效果。采用可人工培養的嗜熱四膜蟲代替魚纖毛類寄生蟲，進行抗蟲藥物大通量篩選，受試材料隨時可得，不受時間、溫度、季節的限制，且具重復性好、經濟適用快速。

技術領域

本發明涉及水產養殖技術領域，具體為一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗纖毛類寄生蟲中草藥物成分的方法。

背景技術

淡水魚類纖毛類寄生蟲包括多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)、車輪蟲(Trichodina sp.)、斜管蟲(Chilodonella sp.)、小車輪蟲等(Trichodinella sp.)等，多子小瓜蟲隸屬寡膜纖毛綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬；車輪蟲和小車輪蟲分屬于寡膜纖毛綱、緣毛亞綱、緣毛目、壺形科、車輪蟲屬和小車輪蟲屬；斜管蟲屬于動基片綱、下口亞綱、管口目、斜管科、斜管蟲屬；其中多子小瓜蟲危害最為嚴重，以往人們篩選抗寄生蟲藥物，是直接采用感染寄生蟲的魚進行試驗，人們從生產實踐中了解到，同一批試驗材料魚，因個體差異，對同一種寄生蟲敏感性不同，魚個體之間感染寄生蟲豐度往往差異較大，感染豐度低的魚體，難以試驗出抗蟲藥物的效果；而感染豐度高的魚體，又易因蟲的危害造成魚體在藥物作用之前急性死亡，因而殺蟲藥物的篩選因作用對象—寄生蟲難以批量穩定獲得、魚體感染程度不均而造成了較大的困難。

前人在小瓜蟲、車輪蟲等寄生蟲藥物篩選方面做了很多嘗試，然而已有在生產中使用的藥物，有的寄生蟲已產生了抗藥性、有的對環境、水產品安全產生威脅，迫切需要替代藥物，來源于植物、動物和礦物的天然藥物因為來源多樣，成份復雜，如果每一種藥物都采用感染寄生蟲的魚進行試驗，工作量大、感染寄生蟲的魚沒有保障，試驗的篩選造成極大的限制，用嗜熱四膜蟲在抗魚纖毛類寄生蟲藥物方面具有廣泛的開發與應用前景，為此我們提出一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，包括如下步驟：

S1、嗜熱四膜蟲的培養

將室溫保存培養基中的嗜熱四膜蟲液1.0mL，轉入裝有9.0mL嗜熱四膜蟲培養基的黑蓋瓶中，28℃～32℃100rpm條件下培養至對數期，再轉接復蘇后的嗜熱四膜蟲至含20mL嗜熱四膜蟲培養基的錐形瓶中培養至對數初期；

S2、嗜熱四膜蟲生長曲線的測定

按3000～5000cells/mL的起始密度接種嗜熱四膜蟲，設置3個平行，于28℃、100rpm的搖床中培養，0～72h間隔6h取一次樣進行計數，84～144h間隔12h進行取樣計數，144h后每隔24h計數，采用血球計數板或細胞計數儀計數，以時間為橫坐標，嗜熱四膜蟲數為縱坐標，繪制嗜熱四膜蟲隨濃度變化的生長曲線；

S3、中草藥水煮液或中藥單體試液的制備

(1)中草藥水煮液制備

稱取30g中草藥原藥加入300mL蒸餾水浸泡30min～60min，加熱至沸騰，文火30min～45min，紗布過濾，濾出藥液，煎煮2次，合并2次濾液，濃縮成30mL，得到濃度為1g/mL的原藥液，0.22um濾膜過濾除菌后，放置于4℃的冰箱保存，備用；

(2)中藥單體試液制備