[發明專利]采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法

在審

• 申請號: 202010035541.3
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111197067A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 潘厚軍;石存斌;常藕琴;張德鋒;任燕;王亞軍;謝駿;黃志斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N33/50
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 涂柳曉

1.一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、嗜熱四膜蟲的培養

將室溫保存培養基中的嗜熱四膜蟲液1.0mL，轉入裝有9.0mL嗜熱四膜蟲培養基的黑蓋瓶中，28℃～32℃100rpm條件下培養至對數期，再轉接復蘇后的嗜熱四膜蟲至含20mL嗜熱四膜蟲培養基的錐形瓶中培養至對數期；

S2、嗜熱四膜蟲生長曲線的測定

按3000～5000cells/mL的起始密度接種嗜熱四膜蟲，設置3個平行，于28℃、100rpm的搖床中培養，0～72h間隔6h取一次樣進行計數，84～144h間隔12h進行取樣計數，144h后每隔24h計數，采用血球計數板或細胞計數儀計數，以時間為橫坐標，嗜熱四膜蟲數為縱坐標，繪制嗜熱四膜蟲隨濃度變化的生長曲線；

S3、中草藥水煮液或中藥單體試液的制備

(1)中草藥水煮液制備

稱取30g中草藥原藥加入300mL蒸餾水浸泡30min～60min，加熱至沸騰，文火30min～45min，紗布過濾，濾出藥液，煎煮2次，合并2次濾液，濃縮成30mL，得到濃度為1g/mL的原藥液，0.22um濾膜過濾除菌后，放置于4℃的冰箱保存，備用；

(2)中藥單體試液制備

中藥單體稱取100mg，加入10mL助溶劑DMSO，即刻加入無菌水90mL，配成含1.0mg/mL(1.0g/L)藥液的母液，DMSO含量為0.1mL/mL(約為0.1mg/mL)。

S4、藥物暴露

室溫保存的嗜熱四膜蟲以5％的接種體積分數接種于100mL已滅菌的嗜熱四膜蟲培養基中，28℃～30℃、100～150rpm搖床培養，至對數生長期(24h～48h)，并進行細胞計數，再用嗜熱四膜蟲培養基稀釋調整為10mL體系且濃度為1.0×10⁴～6.0×10⁴個/mL四膜蟲細胞懸液，加入死亡率0％～100％之間、按等對數間距設置的5～6個濃度的S3所制受試藥物，每個濃度組設置3個平行樣，并設置空白對照(僅有培養基)及陰性對照(有培養基、嗜熱四膜蟲，不加藥物)，于28℃～32℃、100～150rpm的搖床中培養暴露處理24h；

S5、藥物抑制生長濃度的測定

取步驟S4中各濃度藥物暴露處理24h的嗜熱四膜蟲試液，對活細胞數量進行細胞計數，每個樣品計數3次，然后以藥物濃度為橫坐標，活的嗜熱四膜蟲為縱坐標，繪制曲線，用SPSS軟件分析藥物抑制嗜熱四膜蟲生長的半數抑制濃度(IC50),結果用平均值和標準方差(Mean±SD)表示；

S6、CCK8細胞活力的測定

利用含有WST-8的試劑測定CCK8細胞活力，用酶標儀在450nm波長處測定其OD值，從而測定細胞活力隨藥物濃度的變化，用SPSS軟件計算CC50(對50％的嗜熱四膜蟲產生細胞毒性時對應的藥物濃度)，結果用平均值和標準方差(Mean±SD)表示；

S7、結果判定

綜合藥物抑制嗜熱四膜蟲生長的半抑制濃度(S5中IC50)和CCK8細胞活力(S6中CC50)的濃度進行確定，評估中藥對嗜熱四膜蟲的抑制殺滅效果；

S8、對寄生蟲的作用

以嗜熱四膜蟲細胞增殖的半抑制濃度為基礎，參考CCK8細胞活力，設計藥物濃度，添加入飼料中，評估魚類對寄生蟲的作用效果。

2.根據權利要求1所述的一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，其特征在于：步驟S1中，所述嗜熱四膜蟲培養基原料組成包括：多價蛋白胨1.7～2.5％，酵母提取物1.7～2.5％，D-葡萄糖1.7～5.0％，1mL 0.9g/dL的三氯化鐵存儲液存儲液，在增加蒸餾水至1000mL，于121℃高溫滅菌30min，涼后室溫保存。

3.根據權利要求1所述的一種采用嗜熱四膜蟲篩選抗魚纖毛類寄生蟲中草藥成分的方法，其特征在于：步驟S3中(1)的中草藥原藥為中草藥加工成的飲片或粉末，所述中草藥為大黃飲片、青蒿飲片、馬蹄大黃粉末、青蒿粉末中的一種或者幾種；步驟S3中(2)的中藥單體為大黃酸(含量98.2％，粉末)、大黃素(含量99.93％，粉末)、蘆薈大黃素(99.54％，粉末)中的一種或者幾種。