[發明專利]一種TALEN表達載體及其快速制備方法及靶基因和細胞雙標記系統和應用

有效

• 申請號: 202010035004.9
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111235183B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 王進科;張書衍
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種TALEN表達載體及其快速制備方法及靶基因和細胞雙標記系統和應用。本發明可在一天內制備出結合任何18bp靶點的TALEN表達載體比CRISPR更快。本發明由一組線性單體、TALEN骨架質粒，并采用全新流程來組裝TALEN。本發明可輕松高效地獲得即用型TALEN，通過制備五對TALEN并在三種不同細胞系中編輯NF?κB家族基因，證明了本發明制備的TALEN表達載體具有高效性、可重復行、可靠性及適用性。本發明的TALEN具有比CRISPR更高的編輯效率。此外，本發明還公開了一種通過同源定向修復對目標蛋白質和細胞同步標記的雙標記系統，在基因編輯及生物技術領域具有廣泛應用價值。

技術領域

本發明涉及基因編輯生物技術領域，具體涉及一種TALEN表達載體快速制備技術及靶基因和細胞雙標記系統及其應用。

背景技術

轉錄激活因子樣效應物(TALE)是從細菌中發現的天然轉錄激活因子，該因子具有一個可編程的DNA結合結構域(DBD)，該結構域由34個氨基酸序列 (單體)的串聯重復序列以及重復可變雙殘基(RVD)組成。通過與核酸酶FokI 的融合，TALE可形成基因編輯工具TALEN(即TALE-FokI)。TALEN是眾所周知的第二代基因編輯工具，被廣泛用于編輯基因。由于其高靶向性，TALEN已被用于制備通用嵌合抗原受體T細胞(UCAR-T)，用于臨床癌癥免疫治療。然而，隨著CRISPR在2013年的誕生，由于CRISPR的簡單性，TALEN被CRISPR 完全取代。TALEN的致命弱點是其質粒載體構建過程耗時(5天)、勞動密集且效率低下。盡管已開發出一些方法來克服這一關鍵缺點，但它們仍然不能使 TALEN像CRISPR一樣簡單而被廣泛使用。因此，目前仍然非常需要像CRISPR 一樣容易的TALEN制備新方法。

申請人曾經嘗試使用被廣泛應用的TALE組裝試劑盒“Golden Gate TALEN andTAL Effector Kit 2.0(Addgene)”(簡稱Addgene試劑盒2.0)來構建TALE。使用該試劑盒材料及組裝方案，制備一種TALE質粒需5天時間。然而，發現即使花費5天時間完成該方案，也很難獲得可用的TALE質粒。因此，為了提供一種與CRISPR一樣方便的TALE制備方案，申請人決定改進TALE組裝試劑盒和構建流程。通過制備一組新的線性單體(linear monomer)和一個TALE-VP64/VPR 骨架載體，以及設計一個新的組裝流程，申請人開發了一種新的便捷高效的TALE 制備方案(發明專利申請號：201810723261.4)(Molecular Therapy：MethodsClinical Development，2019；13：310-320)。使用該方案，可以很容易地在兩天內高效制備靶向不同DNA序列的TALE-VP64/VPR表達載體，用于轉染細胞，激活各種外源和內源基因(Molecular Therapy：MethodsClinical Development， 2019；13：310-320)。因此，這種TALE-VP64/VPR制備方案為當前各種基于 CRISPR/Cas9-sgRNA的基因激活提供了新的適用性可選方案。

盡管CRISPR是當前廣泛使用的基因編輯工具，但其高脫靶性仍制約其臨床應用。相比之下，脫靶效應對TALEN來說似乎不是問題。通常，TALEN由18 個重復的34個氨基酸序列組成。一對TALEN必須在靶位點的相對兩側結合，并用14～20個核苷酸的“間隔”隔開。這種補償設計(offset design)是必需的，因為FokI需要進行二聚化才能實現其活性。因此，除了靶點，可以預期在基因組中很少再能發現這種很長的(約36bp)的DNA結合位點，即脫靶位點。雖然 RVD-DNA結合密碼有一些簡并性，但在TALEN中幾乎沒有證據表明錯配耐受性或脫靶活性。例如，一項先前的研究表明，人類iPS細胞可被高活性TALEN 編輯，但在與靶位點同源的其他基因組位點未檢測到突變活性(PNAS,2014； 111：9253-9258)。由于其相對不受限制的靶位點要求和高度的特異性，TALEN 在臨床應用中具有超過CRISPR/Cas9的顯著優勢，因此TALEN仍然是基因編輯中一個更有價值的選擇。

發明內容