[發(fā)明專利]一種TALEN表達載體及其快速制備方法及靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010035004.9
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111235183B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設計）人: 王進科;張書衍
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種基于TALEN表達載體的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，所述靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)為TALEN編輯細胞產(chǎn)生雙鏈斷裂后，可用于同源指導修復HDR的兩種線性供體：SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag；所述TALEN表達載體主要由一組線性單體、一種TALEN骨架質粒組裝而成，所述一組線性單體包括60個堿基決定單體和2個連接單體；所述TALEN骨架質粒由強啟動子CMV、TALE-N端序列、LacZ序列、TALE-C端序列及核酸酶FokI序列構成。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于TALEN表達載體的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，所述線性單體可通過通用引物進行高保真PCR擴增再生產(chǎn)；所述LacZ序列可被TALE-DNA結合序列替代并可用藍白斑篩選陽性克隆。

3.根據(jù)權利要求1所述的基于TALEN表達載體的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，所述TALEN表達載體的快速制備方法，包括如下步驟：

（1）四個環(huán)狀五聚體制備

建立N1~N5、N6~N10、dsDNA10.5-N11~N14和N15~N17-dsDNA17.5-N18四個切割-連接反應；其中N1~N18為堿基決定單體，dsDNA10.5與dsDNA17.5為連接單體；其中每個切割-連接反應主要包含BsaI、T4 DNA連接酶和五種單體，制備得到四個環(huán)狀五聚體；

（2）最終TALEN表達質粒制備

建立一個新的切割-連接反應，該反應主要包含BsmBI、T4 DNA連接酶、TALEN骨架質粒以及步驟（1）制備的四種環(huán)狀五聚體，制備得到最終TALEN表達質粒；

（3）細菌轉化及質粒提取

將構建的最終TALEN表達質粒轉化細菌，細菌經(jīng)抗生素液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質粒，得到可用于轉染細胞的TALEN表達載體。

4.根據(jù)權利要求3所述的基于TALEN表達載體的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，步驟（1）和（2）中每個切割-連接反應的溫控程序均為：2~5個循環(huán)：37℃ 3~10分鐘和16℃ 5~15分鐘；50℃ 2~10分鐘；80℃ 2~10分鐘。

5.根據(jù)權利要求3所述的基于TALEN表達載體的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，步驟（1）中每個切割-連接反應結束后，向其中添加質粒安全核酸酶和ATP，在37℃及70℃下依次下孵育10~20分鐘，消除線性DNA片段。

6.根據(jù)權利要求1所述的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，所述SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag，其中SBP為鏈親和素結合肽，AviTag為生物素酶靶點；其中SBP或AviTag可用于標記靶基因，displaySBP與displayAviTag可用于標記細胞；其中SBP或AviTag標記靶基因后，靶基因所表達的蛋白其羧基末端則帶有SBP或AviTag標簽；其中SBP或AviTag標簽可用于靶蛋白及細胞的檢測、富集、分離。

7.根據(jù)權利要求1所述的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)，其特征在于，所述兩種線性供體用于指導目標DNA修復時，可針對該目標DNA設計一對引物PCR，其5′端為35 nt的靶DNA配對序列，其3′端分別為23nt的GS-linker配對序列及24nt的SBP或AviTag配對序列；所述引物可用于PCR擴增SBP-IRES2-displaySBP或AviTag-IRES2-displayAviTag模板，制備用于指導目標DNA修復的線性供體。

8.一種權利要求1所述的靶基因和細胞雙標記系統(tǒng)在基因編輯領域中的應用。

9.根據(jù)權利要求8所述的應用，所述TALEN表達載體為可結合任何18 bp靶點的TALEN表達載體。