[發(fā)明專利]一種TALEN表達(dá)載體及其快速制備方法及靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010035004.9
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111235183B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王進(jìn)科;張書衍
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種基于TALEN表達(dá)載體的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)為TALEN編輯細(xì)胞產(chǎn)生雙鏈斷裂后，可用于同源指導(dǎo)修復(fù)HDR的兩種線性供體：SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag；所述TALEN表達(dá)載體主要由一組線性單體、一種TALEN骨架質(zhì)粒組裝而成，所述一組線性單體包括60個堿基決定單體和2個連接單體；所述TALEN骨架質(zhì)粒由強(qiáng)啟動子CMV、TALE-N端序列、LacZ序列、TALE-C端序列及核酸酶FokI序列構(gòu)成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于TALEN表達(dá)載體的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述線性單體可通過通用引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增再生產(chǎn)；所述LacZ序列可被TALE-DNA結(jié)合序列替代并可用藍(lán)白斑篩選陽性克隆。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于TALEN表達(dá)載體的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述TALEN表達(dá)載體的快速制備方法，包括如下步驟：

（1）四個環(huán)狀五聚體制備

建立N1~N5、N6~N10、dsDNA10.5-N11~N14和N15~N17-dsDNA17.5-N18四個切割-連接反應(yīng)；其中N1~N18為堿基決定單體，dsDNA10.5與dsDNA17.5為連接單體；其中每個切割-連接反應(yīng)主要包含BsaI、T4 DNA連接酶和五種單體，制備得到四個環(huán)狀五聚體；

（2）最終TALEN表達(dá)質(zhì)粒制備

建立一個新的切割-連接反應(yīng)，該反應(yīng)主要包含BsmBI、T4 DNA連接酶、TALEN骨架質(zhì)粒以及步驟（1）制備的四種環(huán)狀五聚體，制備得到最終TALEN表達(dá)質(zhì)粒；

（3）細(xì)菌轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

將構(gòu)建的最終TALEN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，細(xì)菌經(jīng)抗生素液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，得到可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TALEN表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于TALEN表達(dá)載體的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，步驟（1）和（2）中每個切割-連接反應(yīng)的溫控程序均為：2~5個循環(huán)：37℃ 3~10分鐘和16℃ 5~15分鐘；50℃ 2~10分鐘；80℃ 2~10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于TALEN表達(dá)載體的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，步驟（1）中每個切割-連接反應(yīng)結(jié)束后，向其中添加質(zhì)粒安全核酸酶和ATP，在37℃及70℃下依次下孵育10~20分鐘，消除線性DNA片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag，其中SBP為鏈親和素結(jié)合肽，AviTag為生物素酶靶點(diǎn)；其中SBP或AviTag可用于標(biāo)記靶基因，displaySBP與displayAviTag可用于標(biāo)記細(xì)胞；其中SBP或AviTag標(biāo)記靶基因后，靶基因所表達(dá)的蛋白其羧基末端則帶有SBP或AviTag標(biāo)簽；其中SBP或AviTag標(biāo)簽可用于靶蛋白及細(xì)胞的檢測、富集、分離。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)，其特征在于，所述兩種線性供體用于指導(dǎo)目標(biāo)DNA修復(fù)時，可針對該目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)一對引物PCR，其5′端為35 nt的靶DNA配對序列，其3′端分別為23nt的GS-linker配對序列及24nt的SBP或AviTag配對序列；所述引物可用于PCR擴(kuò)增SBP-IRES2-displaySBP或AviTag-IRES2-displayAviTag模板，制備用于指導(dǎo)目標(biāo)DNA修復(fù)的線性供體。

8.一種權(quán)利要求1所述的靶基因和細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述TALEN表達(dá)載體為可結(jié)合任何18 bp靶點(diǎn)的TALEN表達(dá)載體。