[發明專利]基于雙位點基因組編輯獲得高油酸油菜的方法

在審

• 申請號: 202010034529.0
• 申請日: 2020-01-14
• 公開（公告）號: CN111304236A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 柳寒;華水金;林寶剛;朱建方;任韻
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院;湖州市農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了一種基于雙位點基因組編輯獲得高油酸油菜的方法，包括以下步驟：選取能同時作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位點T1、T2和T3、組裝gRNA表達盒、完成A5 FAD2和C5 FAD2雙位點編輯載體的構建、轉入農桿菌GV3101、轉化油菜，經過篩選獲得A5 FAD2和C5 FAD2同時發生突變的轉基因植株。本發明利用CRISPR/Cas9 system以高含油量的半冬性材料B57為受體，同時針對A5和C5上的FAD2基因同時進行編輯，獲得了A5 FAD2和C5 FAD2雙位點同時突變的油菜高油酸材料，其油酸含量在86.4％?89.6％之間。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及利用CRISPR/Cas9系統對甘藍型油菜FAD2基因進行雙位點編輯以獲得高油酸含量的油菜的方法。

背景技術

在油菜不飽和脂肪酸組分中，研究者在油酸對人類健康促進作用的認識深度和廣度上是最為深刻的。研究表明，地中海地區的人們患有心血管疾病的概率要遠低于歐洲其他國家，其主要原因是長期食用含高油酸的橄欖油(Martínez-González and Sánchez-Villegas,2004)。已有證據表明，橄欖油中的油酸含量是降低血壓的關鍵因子之一(Teréset al.,2008)，其不僅有利于降低血壓，在止血系統中也有重要作用，如減少血小板凝聚的敏感性，降低血管性血友病和質膜血栓素B2含量以及溶纖蛋白活性等(Lopez-Miranda etal.，2007)。另一方面，高油酸菜籽油化學性質穩定，較耐貯藏，可延長貨架期，并且高油酸菜籽油能有效進行甲酯化，利于生物柴油的生產。由此可見，高油酸菜籽油不僅僅在健康保健和食品加工方面非常重要，同時在工業應用上也具有重要的作用。因此，培育油菜高油酸品種是今后油菜育種的重要方向，亦是油菜品質改良的重要組成部分。

油菜高油酸品種目前通過品種審定或者品種登記的比較少。其中浙油80是由浙江省農業科學院培育出的全國唯一一個通過審定的品種。隨后，華中農業大學、湖南農業大學等研究單位也有高油酸油菜品種相繼育成并進行品種登記。其中浙油80油酸含量在80％～83％之間，華中農業大學等登記的高油酸品種油酸含量接近80％。

植物種子油酸合成的代謝途徑已經較為清楚，諸多證據表明，在各種油料作物中，通過操縱FAD2基因，減少油酸向亞油酸轉化，可以大幅度提高種子的油酸含量。如在大豆中，FAD2發生突變后，純合體fad2-1a和fad2-1b的油酸含量達到了82％-86％(Pham etal.，2011)。在亞麻中，采用RNAi的方法，將兩個FAD2基因同時沉默后，其籽粒中的油酸含量提高到了80％(Chen et al.，2015)。其他作物如玉米、棉籽、花生、亞麻薺等也可通過改變FAD2基因從而達到提高種子油酸含量的目的。通過以往的這些研究，表明了(1)各個作物種子中油酸含量與FAD2基因密切相關，且具有較高的保守性；(2)FAD2具有很高的可操縱性。即在各作物中，通過遺傳操縱FAD2基因后，種子中的油酸含量均能提高。

CRISPR/Cas9 system是目前最新的基因編輯系統，雖然在油酸改良方面Okuzaki等(2018)利用CRISPR/Cas9 system針對FAD2進行了編輯，但其只編輯了甘藍型油菜A5上的FAD2基因，使用的受體為春油菜Westar，純合的突變體油酸含量從73％提高到了80％，效果并不太顯著。

發明內容

為了克服上述缺陷，本發明提供了一種基于雙位點基因組編輯獲得高油酸油菜的方法，利用CRISPR/Cas9 system以高含油量的半冬性材料B57為受體，同時針對A5和C5上的FAD2基因同時進行編輯，獲得了A5 FAD2和C5 FAD2雙位點同時突變的油菜高油酸材料，其油酸含量在86.4％-89.6％之間。

基于雙位點基因組編輯獲得高油酸油菜的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)選取能同時作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位點T1、T2和T3，其序列如下：