[發明專利]一種改良的微載體活細胞熒光染色方法

在審

• 申請號: 202010033848.X
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111175112A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 陳錦陽;李靜靜;劉軍權
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 郭智

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用微載體技術培養細胞的活細胞熒光染色方法，用來鑒定微載體上細胞的活性。本發明在染色前加入細胞膜通透劑triton X?100以增強細胞通透性，促進染料進入細胞內與核酸結合；染色時，采用無血清培養基作為緩沖液，配制鈣黃綠素?乙酸甲基酯(Caclein?AM)活細胞染色液，更接近細胞生長環境，防止細胞脫落；染色后，加入抗熒光衰減劑DABCO即1,4?二偶氮雙環[2,2,2]?辛烷，有效延長發熒光的時間，從而使檢測結果更精準。使用該方法可以根據發綠色熒光的強度判斷出微載體上貼壁細胞的活性大小，同時不影響細胞的生長。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種微載體培養的活細胞熒光染色方法。

背景技術

微載體一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成，能適用于貼壁細胞的生長，其基本類型主要包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體主要有Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline等。微載體細胞培養技術的基本原理是，將對細胞無害的微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。應用微載體技術可以實現干細胞的規模化獲取，為干細胞治療應用于臨床提供現實基礎。

為了更好地觀察微載體培養的細胞的活性，我們需要借助熒光染色技術。細胞熒光染色是觀察細胞活性的一項重要技術手段，常用的細胞熒光染色方法有很多，如吖啶橙(AO)染色法、溴化乙錠(EB)染色法、熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法、異硫氰酸熒光素(FITC)、碘化丙啶(PI)、Hoechst系列染料、SYTOX系列染料及鈣黃綠素(Calcein)染色等。鈣黃綠素-乙酸甲基酯(Caclein-AM)本身并不是熒光分子，但具有細胞膜透性，通過活細胞內的酯酶作用，Calcein-AM能夠脫去AM基，產生的Calcein能發出強綠色熒光，其激發波長為490nm，發射波長為515nm。因此，Calcein-AM僅對活細胞染色。

上述染色方法利用了活死細胞的細胞膜通透性差異以及染料與核酸物質結合能力的差異或者活死細胞代謝差異對活死細胞分別進行染色，然而這些染色方法存在著三個共同的缺點，即一是細胞通透性較低，染色劑與細胞內的物質難以完全結合發出強烈熒光，因而造成細胞活率較低；二是染色劑滲透壓與細胞生長環境pH的差異容易導致細胞從微載體表面脫落；三是染色劑與細胞結合后發出的熒光容易淬滅，造成活細胞計數時不準確。

發明內容

為了克服上述缺點，本發明公布了一種既能夠增強細胞膜通透性，又能夠延緩熒光淬滅的微載體活細胞熒光染色方法，從而讓細胞活率檢測更精確，使干細胞治療更好地應用于臨床。

本發明采用以下技術方案：

(1)利用微載體技術培養貼壁細胞；

(2)無菌DPBS清洗1-2次，加入細胞膜通透劑triton X-100，室溫孵育10min；

(3)去掉孵育液，無血清培養基清洗1-2次；

(4)用無血清培養基配制Calcein-AM染色液，加入微載體中染色30min；

(5)染色完成后，棄掉染液，加入抗熒光衰減劑DABCO；

(6)DPBS清洗1次，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

本發明針對常規熒光染色過程中，細胞通透性較低，染料與細胞內物質結合較差，造成熒光強度較弱或熒光較易淬滅的現象以及染料與細胞結合過程中，細胞容易脫落的問題進行創新，即在染色前，使用細胞膜通透劑增加細胞膜的通透性；染色時，選擇無血清培養基作為緩沖劑配制染色液，以防止細胞脫落；染色后加入毒性較小的抗熒光衰減劑DABCO，從而大大提高常規熒光染色的準確性。

附圖說明