[發明專利]一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法

有效

• 申請號: 202010033346.7
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111197021B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 劉龍;周人楷;翟秀超;陳泰馳;呂雪芹;李江華;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學;中糧工科（無錫）國際生化技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種L?賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法。本發明的重組谷氨酸棒桿菌是在谷氨酸棒桿菌宿主菌中，將dapA基因的啟動子序列PdapA突變為如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一種，將dapB基因的啟動子序列PdapB突變為如SEQ ID NO.7～9所示的序列中的一種，并將ddh基因的啟動子序列Pddh突變為如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一種。本發明通過對L?賴氨酸生物合成途徑相關基因的改造，構建得到27株重組菌CGL3?1～CGL3?27，其中CGL3?7使得L?賴氨酸的產量得到了顯著提高，達到了62g/l，是原始菌株的的產量的1.48倍。本發明提供了一種改造微生物中L?賴氨酸生物合成途徑提高L?賴氨酸產量的方法，為構建L?賴氨酸的高產菌株提供了理論依據。

技術領域

本發明涉及一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

L-賴氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和動物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-賴氨酸具有平衡氨基酸組成、調節體內代謝平衡、提高機體對谷類蛋白質的吸收及利用率和促進機體生長發育等功能，因此被廣泛應用于飼料、醫藥及食品工業中。

目前，L-賴氨酸生產主要有化學合成法、蛋白水解法和微生物發酵法，其中微生物發酵法生產成本低、生產強度高、對環境污染小，因而成為目前工業生產L-賴氨酸應用最廣泛的方法。目前生產L-賴氨酸的常用菌株包括大腸桿菌、黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌，其中谷氨酸棒桿菌為食品安全級菌株，但其在搖瓶水平的L-賴氨酸產量一直未得到大幅提升。

谷氨酸棒桿菌CICC 23604已經被廣泛應用于工業發酵生產各類氨基酸，其產品被FDA認證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級別。因此，運用代謝工程手段構建重組谷氨酸棒桿菌是生產食品安全級L-賴氨酸的有效途徑。目前，利用表達質粒介導的氨基酸合成途徑中關鍵性酶基因的過表達是對谷氨酸棒桿菌進行基因改造的主要手段。然而利用表達質粒介導基因過表達必將在谷氨酸棒桿菌細胞內引入抗生素抗性基因并在生長過程中添加一定的抗生素，引起人們對抗生素使用的疑慮。因此，提供一種安全高效的對谷氨酸棒桿菌進行遺傳改造的方法，對于生產食品安全級L-賴氨酸有重要的意義。在前期工作中，我們以谷氨酸棒桿菌CICC 23604作為出發菌株，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術，異源表達來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapC，提高胞內NADPH供給；敲除高絲氨酸激酶編碼基因thrB，減少發酵過程副產物蘇氨酸的積累，得到積累L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌基因工程菌，產量達到42g/l。但是L-賴氨酸產量還有待進一步提高，更加適用于工業化生產。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌，以谷氨酸棒桿菌CGGA0T為出發菌株，利用基因隨機突變試劑盒隨機突變L-賴氨酸合成相關基因dapA、dapB和ddh的啟動子序列，并篩選出最適組合得到高產L-賴氨酸的重組谷氨酸棒桿菌CGL3-7。

本發明的第一個目的是提供一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌，所述的重組谷氨酸棒桿菌是在谷氨酸棒桿菌宿主菌中，將dapA基因的啟動子序列PdapA突變為如SEQ ID NO.4～6所示的序列中的一種，將dapB基因的啟動子序列PdapB突變為如SEQ IDNO.7～9所示的序列中的一種，并將ddh基因的啟動子序列Pddh突變為如SEQ ID NO.10～12所示的序列中的一種。

進一步地，所述的谷氨酸棒桿菌宿主菌為谷氨酸棒桿菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒桿菌CGGA0T是在谷氨酸棒桿菌CICC 23604中異源表達來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapC，并敲除高絲氨酸激酶編碼基因thrB。