[發明專利]一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌及其構建方法有效
| 申請號： | 202010033346.7 | 申請日： | 2020-01-13 |
| 公開（公告）號： | CN111197021B | 公開（公告）日： | 2021-09-21 |
| 發明（設計）人： | 劉龍;周人楷;翟秀超;陳泰馳;呂雪芹;李江華;堵國成 | 申請（專利權）人： | 江南大學;中糧工科（無錫）國際生化技術有限公司 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/77;C12P13/08;C12R1/15 |
| 代理公司： | 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257 | 代理人： | 王玉仙 |
| 地址： | 214100 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 賴氨酸 產量 提高 重組 谷氨酸 桿菌 及其 構建 方法 | ||
1.一種L-賴氨酸產量提高的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述的重組谷氨酸棒桿菌是在谷氨酸棒桿菌宿主菌中，將dapA基因的啟動子序列PdapA突變為如SEQ ID NO.4所示的序列，將dapB基因的啟動子序列PdapB突變為如SEQ ID NO.9所示的序列，并將ddh基因的啟動子序列Pddh突變為如SEQ ID NO.10所示的序列；
所述的谷氨酸棒桿菌宿主菌為谷氨酸棒桿菌CGGA0T，所述的谷氨酸棒桿菌CGGA0T是在谷氨酸棒桿菌CICC 23604中異源表達來源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因
2.一種權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）構建突變啟動子的整合片段：合成含有PdapA突變啟動子基因的dapA上下游同源臂片段融合得到重組片段mdapA，合成含有PdapB突變啟動子基因的dapB上下游同源臂片段融合得到重組片段mdapB，合成含有Pddh突變啟動子基因的ddh上下游同源臂片段融合得到重組片段mddh；
（2）構建重組質粒：分別將重組片段與含有sgRNA的線性化載體連接，分別得到含重組片段mdapA的重組質粒、含重組片段mdapB的重組質粒和含重組片段mddh的重組質粒；
（3）構建重組谷氨酸棒桿菌：將含有cas9蛋白的質粒轉化谷氨酸棒桿菌宿主菌，得到谷氨酸棒桿菌CGCas9，然后將重組質粒依次轉化谷氨酸棒桿菌CGCas9，去除外源質粒，得到重組谷氨酸棒桿菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的含有cas9蛋白的質粒包括pFSC質粒。
4.權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌在生產L-賴氨酸中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的應用是將重組谷氨酸棒桿菌在發酵培養基中培養60~80h得到所述的L-賴氨酸，所述的發酵培養基（g/L）：葡萄糖80~100，糖蜜15~25，硫酸銨 50~70，豆粕水解液35~45，七水硫酸鎂 1.0~1.5， 磷酸二氫鉀 1.0~1.2， 醋酸銨2~4，碳酸鈣 15~25，MgSO4?7H2O 0.20~0.3，CaCl2 0.01~0.02，FeSO4?7H2O 0.01~0.02，MnSO4?H2O 0.03~0.05，ZnSO4?7H2O 0.02~0.04，CuSO4?5H2O 0.001~0.003，NiCl2?6H2O0.0020~0.0025，生物素 0.001~0.003。
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