[發明專利]酰胺酶突變體及其在催化合成2-氯煙酸中的應用

有效

• 申請號: 202010032055.6
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111154746B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 鄭仁朝;劉長豐;吳哲明;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發明公開了一種酰胺酶突變體及其在催化合成2?氯煙酸中的應用，屬于酶工程技術領域。所述酰胺酶突變體由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位進行單位點突變或多位點突變獲得。本發明提供的酰胺酶突變體較親本活力大幅提高，在使用該酶的粗提取物或工程菌全細胞進行催化時，反應酶活仍然保持較高狀態。此外，本發明的酰胺酶突變體能夠適應30～55℃的催化溫度，為工業化酶法生產2?氯煙酸奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，具體涉及一種酰胺酶突變體及其在催化合成2-氯煙酸中的應用。

背景技術

2-氯煙酸是一種合成農藥和醫藥的重要中間體化合物。在農藥領域，2-氯煙酸可用于合成磺酰脲類除草劑煙嘧磺隆、酰胺類除草劑吡氟草胺、酰胺類殺菌劑啶酰菌胺以及三唑硫酮類的一系列殺菌活性化合物等；在醫藥領域，2-氯煙酸是合成抗艾滋病藥物-奈韋拉平、抗抑郁藥物-米氮平、非甾體消炎鎮痛藥-尼氟滅酸、普拉洛芬以及煙甲滅酸等的重要中間體。由于2-氯煙酸在農藥和醫藥中的廣泛應用，其市場需求日益增長。

目前，2-氯煙酸的生產方法主要為化學合成法。如以煙酸為起始原料經氮氧化、氯化和水解合成2-氯煙酸；以3-氰基吡啶為原料，經氮氧化、氯化、水解合成2-氯煙酸；2-氯-3-甲基吡啶氧化法；以氰基乙酸乙酯為起始原料的成環法；以2-氯-3-三氟甲基吡啶為起始原料的氯化水解法。

自瑞士Lonza公司于1977年申請了2-氯煙酸合成專利后(US4144238)，日本有機合成和日本光榮化學等化工巨頭先后投身于2-氯煙酸的合成研究(JP59144759；JP56169672)。目前工業上主要采用3-氰基吡啶法生產2-氯煙酸，但其生產工藝存在污染重、合成步驟冗長、收率低等缺陷。

酰胺酶是一類催化酰胺化合物合成相應羧酸的水解酶。因其高立體選擇性、廣底物譜等優勢，以酰胺酶為生物催化劑的(手性)羧酸、(手性)酰胺衍生物及光學純氨基酸的生物合成日益受到研究者的重視。酰胺酶法水解2-氯煙酰胺已成為合成2-氯煙酸的重要方法(CN101857889；Bioorganic Chemistry,2018,76:81-87)。

蛋白質工程和晶體結構解析等技術的發展為酶分子改造提供了強有力工具。在已報道的酰胺酶中，鄭仁朝等構建的泛生菌來源酰胺酶Pa-Ami突變體G175A可高效催化2-氯煙酰胺合成2-氯煙酸(CN201710974605.4)。

構建高催化活力的酰胺酶生物催化劑對于實現2-氯煙酸的高效、綠色生產具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于通過定點飽和突變技術對泛生菌來源(Pantoea sp.)酰胺酶Pa-Ami突變體G175A進行進一步分子改造，提供一種突變體蛋白，提高其對2-氯煙酰胺的水解活力，從而有利于該酰胺酶在2-氯煙酸制備中的應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明在泛生菌來源酰胺酶Pa-Ami突變體G175A(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)基礎上，利用半理性設計方法進一步獲得酶活提高的突變體。所述酰胺酶突變體由SEQID NO.1所示氨基酸序列的第378位、402位或403位進行單位點突變或多位點突變獲得。

具體的，所述的單位點突變為：將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第378位的丙氨酸(A)替換為纈氨酸(V)或蘇氨酸(T)；或將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第402位的纈氨酸(V)替換為亮氨酸(L)；或將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第403位的亮氨酸(L)替換為纈氨酸(V)或蘇氨酸(T)。