[發明專利]一種豬瘟弱毒病毒的培養方法

有效

• 申請號: 202010032054.1
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111172097B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 羅琦;朱佳;張萬林;顧超男;金京勛;夏麗君;莫一群;支銀;王祥;童佳琪
• 申請（專利權）人: 中海生物制藥（泰州）有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/08;A61K39/187;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京象合知識產權代理事務所(普通合伙) 11893
• 代理人: 封明艷;鄭慧娟

本發明公開一種維持原代或傳代細胞系單層的培養方法，其特征在于，培養所用的細胞培養維持液中添加DMSO與IBMX。驗證表明DMSO和IBMX同時添加至細胞培養維持液中，能夠顯著提高長時間后的細胞活性，最佳在連續收獲16代次(65d)后仍能保持較好的細胞活性。本發明的培養方法能夠有效用于弱毒疫苗尤其是豬瘟弱毒疫苗，具有較高有應用價值。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域和獸醫領域，具體涉及一種獸用活疫苗的生產方法，更具體涉及豬瘟弱毒病毒的培養方法。

背景技術

牛睪丸原代細胞是一種用來培養豬瘟病毒的原代細胞。該方法用于繁殖豬瘟病毒，具有免疫原性好、病毒收獲滴度高等特點，且正常培養可連續收獲5代次以上，是目前豬瘟疫苗生產企業最常用的生產方法。現有牛睪丸細胞培養方法中，大部分公司為無添加細胞生長調節劑或者只添加二甲基亞砜的方法進行培養，這些細胞培養方法會出現細胞生長周期短、細胞死亡過快，造成收獲的各代次差異過大，從而影響疫苗質量。牛睪丸原代細胞常規培養方法雖然具有諸多優點，但在現有技術下，全國每年因生產豬瘟疫苗所消耗的牛睪丸達70萬對，過程費時費力，對牛群傷害巨大，因此研究出可以延長原代細胞生長周期，減少收獲病毒各代次間的差異，增加每批次收獲量極為重要。

二甲基亞砜(DMSO)是一種含硫有機化合物，常用于細胞凍存、醫藥生產、有機合成等多種領域。DMSO對細胞膜中的脂質和脂蛋白有穩定作用，可減少凍存及解凍對細胞的傷害。而3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)是一種非特異性cAMP和cGMP磷酸二酯酶抑制劑，已應用于醫學及科研的多個領域。體外培養細胞中加入IBMX，抑制cGMP磷酸二酯酶活性，胞內cGMP濃度升高，促進老化細胞凋亡，維持培養細胞動態平衡。

發明內容

目前尚沒有報道將上述兩種物質用于維持原代或傳代細胞系單層的培養方法之中，本發明通過研究發現兩者添加于培養所用的細胞培養維持液中具有極其顯著的效果，最終完成本發明。

本發明的目的在于提供維持原代或傳代細胞系單層的培養方法，從而解決現在牛睪丸細胞生長周期短、細胞生長狀態差等問題，并基于此提供豬瘟弱毒疫苗株的培養方法，以解決豬瘟收獲批次與質量不穩定等問題。

本發明首先提供一種維持原代或傳代細胞系單層的培養方法，其特征在于，培養所用的細胞培養維持液中添加DMSO與IBMX。

優選地，添加DMSO與IBMX的量分別為：0.1％(V/V)-2.0％(V/V)、10ug/L-1000mg/L，優選添加量為：0.5％(V/V)-1.5％(V/V)、100ug/L-100mg/L，更優選的添加量為：更優選的添加量為：1.5％(V/V)DMSO+10ug/L?IBMX、1.0％(V/V)DMSO+100ug/L?IBMX、0.5％(V/V)DMSO+1000ug/L?IBMX。

進一步地，所述原代細胞為犢牛睪丸細胞、犢牛腎細胞，所述傳代細胞系選自：BT細胞系、豬睪丸傳代細胞系、Vero細胞、豬腎傳代細胞系。

培養所用的細胞培養維持液優選選自：水解乳蛋白-漢克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199。

在一些實施方式中，所述細胞系的培養方式為單層貼壁培養、微載體懸浮培養或固定化培養。

本發明另一方面還提供一種豬瘟弱毒疫苗的培養方法，其包括下述步驟：

(1)如上述的方法培養細胞系；

(2)將豬瘟活疫苗生產種毒接種培養好的傳代細胞系。

進一步還包括：

(3)將豬瘟弱毒疫苗株進行病毒增殖，進行多次收獲；

任選還包括：

(4)在收獲的病毒液中加入凍干保護劑和抗生素進行配苗、冷凍干燥，即得豬瘟弱毒疫苗。