[發(fā)明專利]腈水解酶突變體及在普瑞巴林手性中間體合成中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010032050.3
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111100856B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭仁朝;劉爽;盧夏鋒;吳哲明;鄭裕國
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發(fā)明公開了一種腈水解酶突變體及在普瑞巴林手性中間體合成中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以蕪菁/高山南芥腈水解酶嵌合體BaNIT的三突變體BaNITmut為親本，運用定點突變對127位點和260位點進行改造，所獲得的腈水解酶突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8。相比于親本腈水解酶，本發(fā)明提供的腈水酶突變體催化外消旋異丁基丁二腈的活力及溫度穩(wěn)定性分別有所提高；同時副產(chǎn)物(S)?3?氰基?5?甲基己酰胺含量減少；操作易于控制，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品光學(xué)純度高，在高效催化異丁基丁二腈合成(S)?3?氰基?5?甲基己酸中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及腈水解酶突變體、編碼基因及在催化合成普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

普瑞巴林，化學(xué)名(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的3位異丁基取代物(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,3500)，在治療神經(jīng)疼痛、焦慮以及癲癇等重大疾病中發(fā)揮重要作用。與同類藥物相比，普瑞巴林具有服用劑量低、次數(shù)少、持續(xù)時間長、副作用小和耐受性強等優(yōu)點。由于普瑞巴林R型異構(gòu)體的活性僅為S型的1/10，因此，開發(fā)高光學(xué)純度S型普瑞巴林合成技術(shù)在制藥工業(yè)中具有重要意義。

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是普瑞巴林的關(guān)鍵手性中間體，該化合物經(jīng)一步加氫即可合成S型普瑞巴林。腈水解酶區(qū)域、立體選擇性水解外消旋異丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸路線具有原料廉價、工藝簡單、原子經(jīng)濟性高等優(yōu)勢。但目前已報道的腈水解酶催化活力、立體選擇性低，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。如專利文獻CN1942587B公開的利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和擬南芥腈水解酶催化外消旋異丁基丁二腈水解的產(chǎn)率分別為34.2％、38.6％、35.5％、17.5％，產(chǎn)物光學(xué)純度(ee值)分別為96.3％、91.1％、95.5％和98.5％。

張琴等通過腈水解酶嵌合酶設(shè)計和定點飽和突變，獲得了催化活力和立體選擇性更高的腈水解酶突變體BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(Biotechnol.Bioeng.,2019,doi:10.1002/bit.27203)。但該腈水解酶催化異丁基丁二腈水解時，除生成(S)-3-氰基-5-甲基己酸，還生成副產(chǎn)物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺，其反應(yīng)過程如圖1所示。此外，腈水解酶的熱穩(wěn)定性普遍較低，也阻礙了其工業(yè)應(yīng)用。

因此，開發(fā)能夠高效、高立體選擇性、高反應(yīng)專一性拆分外消旋異丁基丁二腈，且具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性的腈水解酶具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠高效拆分外消旋異丁基丁二腈，且專一性好的腈水解酶，應(yīng)用于催化合成普瑞巴林手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸，滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明以實驗室前期構(gòu)建保藏的蕪菁/高山南芥腈水解酶嵌合體的突變體BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(以下簡稱BaNITmut)為模板(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，對其進行定點飽和突變，得到腈水解酶突變體。

所述腈水解酶突變體及突變位點具體如下：

BaNITmut/M127I(第127位的M突變?yōu)镮)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

BaNITmut/M127I/Q260T(第127位的M突變?yōu)镮、第260位的Q突變?yōu)門)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

BaNITmut/M127I/Q260H(第127位的M突變?yōu)镮、第260位的Q突變?yōu)镠)氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。