[發(fā)明專利]用于推算棕尾別麻蠅幼蟲期發(fā)育時(shí)間的分子標(biāo)記、引物組合物、試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010031936.6
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111100933B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭亞東;任立品;李奕;曲一泓
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 長沙軒榮專利代理有限公司 43235
• 代理人: 羅莎

本發(fā)明公開了一種用于推算棕尾別麻蠅幼蟲期發(fā)育時(shí)間的分子標(biāo)記、引物組合物及檢測試劑盒和應(yīng)用，分子標(biāo)記為SpGALM37.59目的基因，引物組合物包括GALM?F和GALM?R。用于推算棕尾別麻蠅幼蟲期發(fā)育時(shí)間的試劑盒，包括引物組合物和緩沖液。SpGALM37.59目的基因參與碳水化合物合成，同時(shí)在不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)顯著；結(jié)合qRT?PCR技術(shù)篩選出幼蟲期發(fā)育時(shí)間推算的分子遺傳標(biāo)記，構(gòu)建差異表達(dá)基因與發(fā)育時(shí)間的回歸方程以進(jìn)行不同發(fā)育階段輔助判定，可用于推算棕尾別麻蠅幼蟲期發(fā)育時(shí)間，為實(shí)際案件中PMI推斷應(yīng)用提供更加科學(xué)、客觀、公正的數(shù)據(jù)參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于推算棕尾別麻蠅幼蟲期發(fā)育時(shí)間的分子標(biāo)記、引物組合物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

法醫(yī)昆蟲學(xué)(Forensic entomology)是應(yīng)用昆蟲學(xué)知識解決有關(guān)法律問題的法醫(yī)學(xué)分支科學(xué)，對死亡時(shí)間的推斷，特別是腐敗尸體的死亡后間隔時(shí)間(postmorteminterval,PMI)的推斷具有獨(dú)特優(yōu)勢。利用嗜尸性蠅類非成蟲期(卵、幼蟲、蛹)的形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)結(jié)合環(huán)境溫度等條件，判斷其發(fā)育階段和計(jì)算發(fā)育到該階段所經(jīng)歷時(shí)間，是現(xiàn)有PMI推斷的主要理論依據(jù)。嗜尸性蠅類在不同環(huán)境溫度中生長發(fā)育速率存在明顯差異，因此發(fā)育階段的準(zhǔn)確判斷是PMI推斷中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前主要以1)直接法，即根據(jù)特定蠅類具有時(shí)序性變化的體長及體重等，結(jié)合尸體現(xiàn)場的環(huán)境溫、濕度等數(shù)據(jù)直接推斷日齡，進(jìn)而應(yīng)用于PMI推斷；2)間接推斷法，或稱為有效積溫法，即將現(xiàn)場采集幼蟲帶回實(shí)驗(yàn)室在一定的溫、濕度條件下飼養(yǎng)、觀察，直至下一蟲態(tài)，再應(yīng)用有效積溫法則，間接推斷蠅類的日齡以應(yīng)用于PMI推斷。雖然近年來上述方法用于PMI推斷的可行性已被理論和案例所證明，但存在人為設(shè)定指標(biāo)及主觀性較強(qiáng)等弊端，以及外界環(huán)境因素的干擾等，使其客觀性、準(zhǔn)確性及可重復(fù)性受到質(zhì)疑，因此現(xiàn)有發(fā)育階段判斷體系并不能讓其在法庭科學(xué)中發(fā)揮出應(yīng)有的價(jià)值。

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)基因差異表達(dá)用于昆蟲日齡推斷的科學(xué)性及可行性。2002年Science首次公開證實(shí)，不同日齡的黑腹果蠅基因表達(dá)具有差異性，提示差異基因表達(dá)可應(yīng)用于蠅類的日齡推斷。2007年有研究者將在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的與卵發(fā)育相關(guān)的3種基因(bcd，sll，cs)應(yīng)用到絲光綠蠅，發(fā)現(xiàn)這三種基因的表達(dá)水平與卵的發(fā)育時(shí)間呈線性關(guān)系，甚至可以精確到2小時(shí)內(nèi)。隨后2011年再次證實(shí)多個(gè)差異基因的表達(dá)與絲光綠蠅幼蟲及蛹的發(fā)育存在時(shí)序性變化關(guān)系。但考慮到物種之間基因功能的異質(zhì)性，將果蠅這種模式物種被發(fā)現(xiàn)的基因功能單純拷貝到其他物種中進(jìn)行驗(yàn)證，顯然缺乏一定的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性。

隨著高通量測序技術(shù)的興起，在分子生物學(xué)中聯(lián)合多基因組學(xué)研究某些表達(dá)因子的具體功能機(jī)制已成為熱點(diǎn)。2018年基于RNA-seq測序?qū)坌?shí)蠅(Bactrocera dorsalis)從離食期至化蛹的不同發(fā)育階段差異基因功能富集分析，編碼氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)和保幼激素(juvenile hormone(JH))通路的相關(guān)基因顯著下調(diào)，蛻皮激素(20-hydroxyecdysone)和幾丁質(zhì)消化酶(chitinolytic enzymes)通路相關(guān)基因顯著上調(diào)。2015年Zajac等對紅頭麗蠅15個(gè)不同蛹期樣本進(jìn)行de novo轉(zhuǎn)錄組測序分析，首次建立了紅頭麗蠅蛹期不同發(fā)育階段生物分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，同時(shí)也為差異表達(dá)基因在法醫(yī)昆蟲不同發(fā)育階段推斷應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。因此，差異表達(dá)基因具有應(yīng)用于不同發(fā)育歷期發(fā)育時(shí)間推算的潛在價(jià)值。