[發明專利]一種引物探針組合物及檢測方法和用途

在審

• 申請號: 202010031581.0
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111118140A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 蔡燕寧;張陸明
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 宋秀蘭

本發明涉及生物技術技術領域，具體涉及一種引物探針組合物及檢測方法和用途，所述引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1?2和SEQ ID NO.7?8中的至少兩種，所述探針的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3?6和SEQ ID NO.9?12中的至少兩種，所述引物探針組合物可用于檢測SNCA基因DNA甲基化水平，用于制備診斷或監測帕金森病及其相關疾病發生發展的產品。本發明具有成本低，操作簡單的優點，提高了檢測的效率，在全封閉狀態下進行PCR擴增和產物分析，杜絕了普通PCR開放檢測對環境和樣本的污染，并且可定量分析SNCA基因DNA甲基化水平。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種引物探針組合物及檢測方法和用途。

背景技術

α-突觸核蛋白是一種在中樞神經系統突觸前及核周表達的可溶性蛋白質，它與帕金森病的發病機制和相關功能障礙密切相關。中樞神經系統是神經系統中神經細胞集中的結構，在脊椎動物包括腦和脊髓；在高等無脊椎動物如環節動物和昆蟲等，則主要包括腹神經索和一系列的神經節。人的中樞神經系統構造最復雜而完整。

SNCA基因編碼的α-突觸核蛋白是由140個氨基酸組成，分子量為19kDa的高度保守的小分子蛋白質，主要存在于神經元突觸前末梢，具有調節神經遞質的釋放和再攝取、突觸囊泡再循環等功能。α-突觸核蛋白在神經元中的作用與其濃度密切相關，低濃度時對神經元有保護作用，高濃度或過表達時對神經元有細胞毒性作用。

大量研究表明SNCA基因在帕金森病的發生發展中發揮著重要作用。首先，α-突觸核蛋白是帕金森病病理標記物路易小體的重要組成部分；其次，SNCA突變以及拷貝數變異能夠導致家族性帕金森病，而其基因多態性是散發帕金森病的危險因素；第三，SNCA突變、α-突觸核蛋白過表達、α-突觸核蛋白寡聚體能夠引起模式動物產生帕金森樣病理改變。

SNCA基因定位于人染色體4q21-23上(NC_000004.12，89724099-89838324)，跨度大約110kb，包含有6個外顯子和若干內含子，SNCA基因啟動子以及第一外顯子區富含GC，存在典型的CpG島結構。

CpG島區的DNA甲基化修飾幾乎存在于所有高等生物中。DNA甲基化可以關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。在哺乳動物中，DNA發生甲基化僅在CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化修飾轉移酶(DNMTs)的作用下，使5’-CpG-3’二核苷酸5′端的胞嘧啶生成5-甲基胞嘧啶(m5c)。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但可調控基因的表達，甲基化程度與轉錄活性呈反比。DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學機制，其在維持正常細胞功能、染色質結構修飾、X染色體失活、基因組印跡、胚胎發育以及人類腫瘤發生起著重要作用。

研究表明，帕金森及其相關疾病患者外周血基因組DNA中SNCA基因啟動子以及第一外顯子區的CpG島出現了顯著的低甲基化。這一低甲基化可能引起α-突觸核蛋白表達的升高，并進一步促進帕金森及其相關疾病的發生發展。大量研究提示，通過分析該區域的甲基化水平，能夠輔助帕金森及其相關疾病的早期預警、診斷和鑒別診斷。因此，針對該區域甲基化，建立一種簡單、高通量、易于臨床檢測、成本低廉的檢測方法非常重要。

甲基化檢測方法主要有亞硫酸鹽二代測序法、亞硫酸鹽一代測序法、焦磷酸測序法以及甲基化特異PCR。其中亞硫酸鹽二代測序法成本較高，不適用大規模應用；亞硫酸鹽一代測序法操作步驟多，費時費力；焦磷酸測序法通量高，可定量分析，但操作步驟較多；甲基化特異PCR法較為簡單，但僅可定性分析。

中國專利申請CN106636306A公開了一種用于結直腸癌中相關基因啟動子甲基化的檢測方法，其中一種熒光PCR定性檢測基因SNCA的甲基化引物及探針序列分別為上游引物GCGTTTTGGGCGTTTTTTTAC，下游引物CGCTATAAACCGACGACGC，探針6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAA-MGB。但是該專利申請主要是利用SNCA等相關基因的甲基化程度輔助診斷結直腸癌，所公開的引物和探針對于帕金森及其相關疾病沒有任何輔助診斷作用。