[發(fā)明專利]一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010030832.3
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111154820B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙偉;唐嘉婕;高鵬飛;楊敬敏;李文濤
• 申請（專利權(quán)）人: 上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12P19/34
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 嚴(yán)晨;許亦琳

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法。本發(fā)明提供一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法，包括：在SD聚合酶存在的條件下對模板核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以提供擴(kuò)增產(chǎn)物，所述模板核酸包括重復(fù)序列，所述重復(fù)序列包括多個重復(fù)單元，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的復(fù)制滑移率≤8%。本發(fā)明所提供的降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法及其相關(guān)試劑盒、以及PCR擴(kuò)增體系，能夠有效減少核酸擴(kuò)增中出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增和復(fù)制滑移，其擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物具有優(yōu)良的擴(kuò)增忠實性，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法。

背景技術(shù)

所謂重復(fù)序列，就是在組成生物的DNA中，重復(fù)出現(xiàn)的堿基序列。重復(fù)基因在生物基因組中廣泛存在，如人類基因組中重復(fù)序列占比超過1/3。這些重復(fù)序列種類繁多，大多數(shù)還未確定其具體功能，但有研究已證明一些特定的重復(fù)序列在基因表達(dá)，調(diào)控和遺傳等方面起著十分重要的作用。另外，重復(fù)序列是基因組不穩(wěn)定的重要原因之一。基因組是動態(tài)結(jié)構(gòu)，在生物體的生命過程中，基因會發(fā)生置換、移碼、缺失、插入突變。重復(fù)序列由于其重復(fù)性高，在復(fù)制過程中極易產(chǎn)生插入或缺失重復(fù)單元，重復(fù)序列的再結(jié)合也可以導(dǎo)致染色體組的重組。

現(xiàn)階段對重復(fù)序列的檢測主要采用基于PCR技術(shù)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性檢測。此項技術(shù)中最嚴(yán)重的錯誤是擴(kuò)增過程中發(fā)生復(fù)制滑移現(xiàn)象，即PCR過程中產(chǎn)生重復(fù)序列發(fā)生一個或幾個重復(fù)單元的缺失或插入。

DNA復(fù)制過程中，因為子代鏈的插入或者模板鏈的脫落導(dǎo)致的引物-模板復(fù)合物在引物延伸的過程中發(fā)生錯配，此時引物或者模板滑落導(dǎo)致一個重復(fù)單位形成堿基非配對環(huán)，這樣導(dǎo)致其增加或減少一個或幾個重復(fù)單位。這樣的結(jié)構(gòu)在擴(kuò)增基因含短重復(fù)序列的PCR過程中較易出現(xiàn)。

如果復(fù)制滑移片段比例較高，則無法區(qū)分目的片段因擴(kuò)增效率不同而導(dǎo)致的目的片段擴(kuò)增及復(fù)制滑移產(chǎn)物。這種結(jié)果直接導(dǎo)致無法對結(jié)果進(jìn)行判別。因此，需要一種可降低復(fù)制滑移率的pcr方法，用以提高擴(kuò)增片段長度多態(tài)性檢測的分辨率，降低假陽性或無法判別的可能。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明一方面提供一種降低核酸擴(kuò)增復(fù)制滑移率的方法，包括：在SD聚合酶存在的條件下對模板核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以提供擴(kuò)增產(chǎn)物，所述模板核酸包括重復(fù)序列，所述重復(fù)序列包括多個重復(fù)單元，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的復(fù)制滑移率≤8％；

復(fù)制滑移率＝復(fù)制滑移片段峰面積/(目標(biāo)片段峰面積+復(fù)制滑移片段峰面積)×100％。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的非特異性擴(kuò)增率≤8％；

非特異性擴(kuò)增率＝(復(fù)制滑移片段峰面積+其他非目的產(chǎn)物峰面積)/(復(fù)制滑移片段峰面積+其他非目的產(chǎn)物峰面積+目標(biāo)片段峰面積)×100％。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述重復(fù)序列中，重復(fù)單元的長度為1～20個bp，優(yōu)選為1～6個bp，更優(yōu)選為3～5bp。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述重復(fù)單元選自ATAG。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述重復(fù)序列包括3～5個重復(fù)單元，模板核酸的長度不大于1000bp。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述對模板進(jìn)行擴(kuò)增中所使用的PCR體系包括：模板核酸、SD聚合酶、dNTPs。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述PCR體系還包括針對所述模板核酸的上游引物和下游引物。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述PCR體系還包括擴(kuò)增促進(jìn)劑，優(yōu)選的，所述擴(kuò)增促進(jìn)劑選自甜菜堿、SSB、DMSO中的一種或多種的組合。

在本發(fā)明一些實施方式中，所述PCR體系還包括水性介質(zhì)、緩沖液、鎂離子中的一種或多種的組合。