[發明專利]一種利用雙熒光素酶報告基因檢測西方蜜蜂Dnmt3基因啟動子活性的方法

在審

• 申請號: 202010030826.8
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111154780A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 王子龍;李茫;張麗珍;曾志將;吳小波
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/66;C12N15/85;C12Q1/6876
• 代理公司: 江西省專利事務所 36100
• 代理人: 殷勇剛

1.一種利用雙熒光素酶報告基因檢測西方蜜蜂Dnmt3基因啟動子活性的方法，包括以下步驟：

（1）載體構建

（1.1）從NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載預測的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因組序列，利用Bioedit軟件從西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因編碼區序列；

將西方蜜蜂Dnmt3基因編碼區序列與西方蜜蜂基因組序列進行比對，確定西方蜜蜂Dnmt3基因翻譯起始密碼子“ATG”在西方蜜蜂基因組序列上的具體位置；

再在西方蜜蜂基因組序列上選取西方蜜蜂Dnmt3基因翻譯起始密碼子“ATG”之前2256bp的片段作為啟動子區域片段，并進一步將啟動子區域片段依次截短成950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的啟動子片段；

將上述啟動子片段用EcoRI、NotI進行雙酶切，酶切后啟動子片段的兩端帶有EcoRI和NotI酶切位點；

（1.2）制備酶切后的雙熒光素酶報告基因檢測載體質粒，

將雙熒光素酶報告基因檢測載體質粒用EcoRI、NotI進行雙酶切，酶切后雙熒光素酶報告基因檢測載體質粒的兩端帶有EcoRI和NotI酶切位點；

（1.3）將步驟（1.1）獲得的酶切后啟動子片段與步驟（1.2）獲得的酶切后雙熒光素酶報告基因檢測載體質粒進行連接；

（1.4）篩選重組子，其步驟包括，

（1.4.1）取連接產物直接轉化JM109感受態細胞，向轉化后的JM109感受態細胞中加入1ml的LB培養基，隨后置于恒溫搖床中于37°C下200轉/分鐘搖菌1小時；

然后取200μl轉化后的JM109感受態細胞涂在含有氨芐青霉素的培養平板上，將平板置于恒溫培養箱中于37°C過夜培養；

（1.4.2）從培養平板上隨機挑取菌落于5ml的LB培養基中，37°C下250轉/分鐘搖菌14小時，用菌液進行PCR鑒定，取陽性克隆菌液測序；

（1.4.3）經過測序驗證后，使用質粒抽提試劑盒提取陽性克隆重組子，以備轉染；

（1.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的啟動子片段進行步驟（1.3）-步驟（1.4）操作，獲得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的啟動子片段的陽性克隆重組子；

（2）細胞轉染

用于轉染的細胞系所使用DNA與lip2000的比值為1μg：2～3μl；

（2.1）轉染前24小時，將用于轉染的細胞系接種至每孔含有500μl不含抗生素的培養基的24孔細胞培養板中，在轉染時用于轉染的細胞系可長至90-95%融合；

（2.2）轉染液制備，每孔細胞用量如下：

（2.2.1）用50μl的Opti-ME I低血清培養基稀釋所述步驟（1.5）獲得的陽性克隆重組子，輕輕混勻；

（2.2.2）輕輕搖勻lip2000，之后分別取3μl的lip2000在50μl的Opti-ME I培養基中稀釋，室溫孵育5分鐘；

（2.2.3）將前兩步所稀釋的陽性克隆重組子和lip2000輕輕混勻，室溫放置20分鐘，獲得轉染液；

（2.3）在步驟（2.1）所述24孔細胞培養板的每孔細胞中加入100μl步驟（2.2）制備的轉染液，輕輕搖勻，進行細胞轉染；

（2.4）孵箱中37°C下培養18-48小時后檢測基因表達，獲得轉染后細胞系；

（2.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的啟動子片段的陽性克隆重組子進行步驟（2.2）-步驟（2.4）操作，獲得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的啟動子片段的陽性克隆重組子轉染的轉染后細胞系；

（3）雙熒光素酶檢測

（3.1）試劑準備

按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒E1910說明書配制PLB細胞裂解液、LAR II檢測液、StopGlo檢測液；

（3.2）樣品準備

按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒E1910說明書使用PLB細胞裂解液裂解步驟（2）獲得的轉染后細胞系，取20μl裂解后的細胞系裂解液；

（3.3）檢測過程

（3.3.1）取20μl步驟（3.2）獲得的裂解后的細胞系裂解液置于1.5ml離心管中，然后加入100μl的LARII檢測液，混合后放入Biotek Synergy2酶標儀檢測第一次發光值；

（3.3.2）再加入StopGlo檢測液，終止第一次發光，同時開始第二次發光，混合后放入Biotek Synergy2酶標儀檢測第二次發光值；

（3.4）數據分析

以螢火蟲熒光素酶基因Luc作為內參基因，將24孔細胞培養板的各孔Rluc的熒光值與Luc的熒光值進行比較，得到Rluc/Luc比值；

以雙熒光素酶報告基因檢測載體質粒為陰性對照，將實驗組的Rluc/Luc值與陰性組的Rluc/Luc值進行統計分析，分析實驗組的變化，若實驗組Rluc/Luc值顯著高于陰性組Rluc/Luc值，則說明該啟動子具有啟動活性。