[發(fā)明專利]一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)西方蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子活性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010030826.8
• 申請(qǐng)日: 2020-01-13
• 公開（公告）號(hào): CN111154780A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王子龍;李茫;張麗珍;曾志將;吳小波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/52
• 分類號(hào): C12N15/52;C12N15/66;C12N15/85;C12Q1/6876
• 代理公司: 江西省專利事務(wù)所 36100
• 代理人: 殷勇剛

本發(fā)明公開了一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)西方蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子活性的方法，包括以下步驟：（1）載體構(gòu)建；（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染；（3）雙熒光素酶檢測(cè)。本發(fā)明將蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子區(qū)截短成6個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA片段，將各個(gè)片段克隆到pmirGLO載體質(zhì)粒構(gòu)建成雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)載體質(zhì)粒，隨后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染及啟動(dòng)子活性檢測(cè)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，具有較高的可重復(fù)性和準(zhǔn)確度，不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，為研究西方蜜蜂Dnmt3通路及其它基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了有效的檢測(cè)工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)啟動(dòng)子活性技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)西方蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子活性的方法。

背景技術(shù)

蜜蜂是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是典型的社會(huì)性昆蟲。在正常的蜂群中，通常有一只蜂王，數(shù)百至上千只雄蜂（有季節(jié)性出現(xiàn)）和數(shù)千至數(shù)萬只工蜂。蜂王和工蜂都是雌性蜂，由遺傳物質(zhì)完全相同的受精卵發(fā)育而來，但是二者在生理、行為方面差異很大。蜂王和工蜂的級(jí)型分化是一種典型的表觀遺傳現(xiàn)象。表觀遺傳是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。表觀遺傳和非編碼RNA調(diào)控、DNA甲基化和組蛋白乙酰化等相關(guān)。其中DNA甲基化是一種很廣泛的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，它是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，Dnmts）的作用下，將甲基添加在DNA分子中的堿基上，從而影響基因的表達(dá)。西方蜜蜂體內(nèi)擁有一套完整的DNA甲基化系統(tǒng)，擁有3種5-甲基胞嘧啶DNA轉(zhuǎn)移酶，分別是Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3。DNA甲基化是調(diào)節(jié)蜜蜂級(jí)型分化的一個(gè)重要因素，Kucharski等（2008）用顯微注射對(duì)西方蜜蜂的工蜂幼蟲Dnmt3基因進(jìn)行RNAi，結(jié)果表明：降低Dnmt3基因的表達(dá)可誘導(dǎo)西方蜜蜂幼蟲發(fā)育成蜂王，且蜂王Dynactin p62基因的甲基化程度降低。這說明Dnmt3基因是調(diào)控蜂王和工蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵基因。

研究者對(duì)蜂王和工蜂間的甲基化差異進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)蜂王幼蟲和工蜂幼蟲、蜂王腦部和工蜂腦部等均存在著廣泛的甲基化差異。這表明由Dnmt3控制的DNA甲基化廣泛地影響著蜂王和工蜂之間生殖、行為、壽命等方面的級(jí)型差異。目前，Dnmt3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。所以本申請(qǐng)對(duì)Dnmt3基因進(jìn)行了不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的分析，為以后在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中能夠更好地利用該啟動(dòng)子培育優(yōu)良蜂王提供指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)西方蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子活性的方法，它具有靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題，

一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)西方蜜蜂Dnmt3基因啟動(dòng)子活性的方法，包括以下步驟：

（1）載體構(gòu)建

（1.1）從NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載預(yù)測(cè)的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因組序列，利用Bioedit軟件從西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因編碼區(qū)序列；