[發(fā)明專利]一種嵌合抗原受體-單核/巨噬細胞(CAR-M)的構建及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010029500.3
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN113106067A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設計）人: 沈萍萍;章文龍;貝云成;黃亞紅
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;A61K35/15;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體?單核/巨噬細胞(CAR?M)的構建及其應用。運用基因編輯手段設計、優(yōu)化適于導入單核/巨噬細胞細胞膜組構的基因工程受體分子作為嵌合抗原受體，包括前導肽，識別區(qū)，鉸鏈區(qū)和跨膜/胞內信號區(qū)，具體地，所述嵌合抗原受體包括如SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.18所示的序列。本發(fā)明還涉及上述嵌合抗原受體?單核/巨噬細胞(CAR?M)的應用，本發(fā)明采用單核/巨噬細胞作為細胞免疫治療的載體細胞，是利用其良好的組織浸潤性與細胞因子趨化性，可以解決CAR?T無法進入實體瘤內部的問題。本發(fā)明利用嵌合抗原受體賦予單核/巨噬細胞對腫瘤細胞的靶向性，并增強對腫瘤細胞的吞噬，進一步可以遞呈腫瘤抗原給T細胞，增強抗腫瘤免疫。本發(fā)明所構建的嵌合抗原受體?單核/巨噬細胞(CAR?M)可用于肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等實體瘤的細胞免疫治療。

技術領域：

本發(fā)明屬于免疫治療技術領域，具體涉及嵌合抗原受體-單核/巨噬細胞(CAR-M)的構建及其應用。

背景技術：

目前國際上用于細胞免疫治療的細胞主要分為兩大類：第一類包括淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、自然殺傷細胞(NK)及細胞因子誘導殺傷細胞(CIK)等；第二類是具有腫瘤抗原特異性的T淋巴細胞，包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、細胞毒性T細胞(CTL)。其中第一類技術體系較為簡單，尤其是CIK細胞的治療在我國較為流行，第二類的技術體系相對復雜，細胞培養(yǎng)周期較長，培養(yǎng)的成功率相對較低，但由于對殺傷腫瘤細胞具有高度的特異性，因此療效更為明顯。CAR-T是基于以上兩類研究獲得的新的治療細胞，CAR是Chimericantigen receptor(嵌合抗原受體)的縮寫，CAR-T細胞免疫治療是將患者的T細胞通過基因工程修飾，加上一個嵌合抗原受體，然后經過體外擴增再回輸至病人體內。在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液系統腫瘤的治療上，CAR-T細胞已取得顯著的療效。然而CAR-T細胞免疫治療在實體瘤臨床治療過程中遭遇了前所未有的挑戰(zhàn)：1)實體瘤細胞外基質阻礙了CAR-T細胞浸潤；2)實體瘤免疫抑制微環(huán)境(大量浸潤的免疫抑制細胞，Treg、TAMs、MDSC等；免疫抑制細胞因子，TGF-β、IL-10等；抑制蛋白的表達，PD-1/PD-L1、CTLA-4等)抑制CAR-T腫瘤殺傷活性；3)實體瘤高度異質性使得CAR-T細胞療法缺乏有效的腫瘤抗原。

巨噬細胞具有強大的吞噬功能，每天可以清除大約2×10¹¹個紅細胞，相當于每年機體可以循環(huán)利用3kg的血紅蛋白。另外，巨噬細胞在吞噬、抗原遞呈、免疫平衡調節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，對維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的監(jiān)視功能。巨噬細胞通過表面受體能夠偵查出周圍環(huán)境中的組織損傷信號或微生物入侵信號，一旦發(fā)現異常，即可誘導出巨噬細胞的吞噬作用和抗原遞呈作用，促進機體的特異性免疫反應。例如肺泡巨噬細胞能有效清除肺部的過敏原；肝巨噬細胞(Kupffer細胞)能幫助清除血液中循環(huán)的病原體和毒素。巨噬細胞還能吞噬免疫原性死亡的腫瘤細胞并遞呈腫瘤抗原給T細胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。

然而，近年來研究發(fā)現，腫瘤組織中的腫瘤細胞或其他細胞通過釋放CCL2、CXCL12、 CSF1等趨化因子招募巨噬細胞浸潤，在實體瘤微環(huán)境中巨噬細胞是浸潤比例最高的免疫細胞。腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞又稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associatedmacrophages， TAMs)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移中發(fā)揮重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞可通過CD47、 MHCI分子與巨噬細胞上的受體結合，抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬。同時，調控TAMs 中的脂質代謝，促進脂滴堆積，導致巨噬細胞的吞噬能力受損。因此，腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞雖然具備殺傷腫瘤細胞的潛能，卻由于腫瘤細胞表面CD47等分子的抑制作用，導致 TAMs不僅不殺死腫瘤細胞，還可以通過促進血管增生等作用，促進腫瘤的生長。

基于此，我們將單核/巨噬細胞作為細胞免疫治療的載體細胞，結合目前嵌合抗原受體技術蓬勃發(fā)展的優(yōu)勢與日漸成熟的基因優(yōu)化技術，從分子水平上改造單核/巨噬細胞，制備獲得嵌合抗原受體-巨噬細胞(CAR-M)，利用其高效浸潤性，增強其吞噬能力及抗原遞呈能力，使CAR-M有望成為細胞免疫治療的新一代主角。

發(fā)明內容