[發明專利]一種嗅鞘細胞的純化培養方法

有效

• 申請號: 202010023267.8
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111019895B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 沈憶新;李健;張宇
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種嗅鞘細胞的純化培養方法。本發明通過在培養早期階段采用Forskolin增加了部分嗅鞘細胞的貼壁能力，再利用低濃度胰酶消化后，去除其他類型的細胞，對留下的細胞進行培養擴增后，采用正常濃度的胰酶消化后重懸培養，通過上述方法，得到的嗅鞘細胞亞型單一、純度大于98％且細胞能夠長期存活，因此能夠為脊髓損傷的病人提供穩定的種子細胞，為解決嗅鞘細胞移植治療效果不穩定及并發癥多的問題提供一種新的手段。

技術領域

本發明涉及一種嗅鞘細胞的純化培養方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

脊髓損傷(spinal?cord?injury,SCI)是一種嚴重的中樞神經系統疾病,具有高致殘率、青壯年多發等特點，不僅給患者帶來嚴重的心理和生理傷害,還會給家庭及社會帶來巨大的經濟負擔，流行病學資料顯示,SCI世界年發病率較高，每百萬人口為3.6～195.4例，因此脊髓損傷治療顯得尤為重要。

嗅鞘細胞是一類特殊的神經膠質細胞，主要存在于嗅粘膜和嗅球中，對嗅覺神經系統的持續再生起了重要的作用，它具有促進軸突再生、神經營養，成髓鞘化等功能。它主要有星形膠質樣和施旺細胞樣兩種亞類，星形膠質樣嗅鞘細胞形狀呈扁平型，而施旺樣嗅鞘細胞呈雙極梭形，這兩種亞型在一定套件下能夠相互轉換。

近年來，嗅鞘細胞移植是脊髓損傷修復的前言領域。很多研究報道了移植嗅鞘細胞能夠使脊髓損傷病人恢復部分感覺功能及運動功能，并且發現嗅鞘細胞有與施旺細胞類似的成髓鞘能力。然而，臨床研究也發現，由于嗅鞘細胞純度不一，導致嗅鞘細胞移植后病人治療效果不穩定且出現了較多的并發癥，因此尋找一種高效的純化嗅鞘細胞的方法就迫在眉睫。目前純化嗅鞘細胞的方法有很多，主要的原理包括：利用細胞粘附差異篩選，細胞表面抗原篩選、不同胰酶濃度篩選以及利用不同選擇性培養基進行篩選。隨著細胞純化方法的不斷改進，嗅鞘細胞的活力和純度也因此提高。

目前，有很多不同的方法來純化嗅鞘細胞，不過各有優缺點。Nash等人利用細胞粘附差異來純化嗅鞘細胞的方法比較簡單，獲得的嗅鞘細胞的純度能夠達到93％以上，但是純度隨著傳代次數的增加不斷下降，因此不能夠為細胞移植提供大量、穩定的移植細胞。免疫粘附法、熒光激活細胞分類等方法需要使用抗體進行篩選，操作復雜，成本較高，并且對細胞的活力有較大的影響。目前利用細胞粘附差異和結合選擇性培養基的純化方法，能夠保持嗅鞘細胞高純度的同時，保持嗅鞘細胞的活力。Liudmila?N等人發現，使用差速貼壁方法后，單純使用10％FBS?DMEM/F12培養基培養基一周后，嗅鞘細胞的純度及下降至40％。

Forskolin是一種腺苷酸環化酶激活劑，可以通過細胞膜，激活腺苷酸環化酶，使cAMP水平增高，進而激活蛋白激酶A(PKA)，活化的PKA可以磷酸化多種轉錄因子，進而調控細胞的粘附、增殖、分化。有研究表明，Forskolin作為有絲分裂原能夠促進嗅鞘細胞的增殖，但是Forskolin與不同細胞增殖劑組合對于嗅鞘細胞的純度及細胞活力影響也較大。利用Forskolin和GGF2(神經營養因子2)的選擇性培養基，卻能夠使嗅鞘細胞保持純度在90％-95％，并且能夠存活較長時間(至少十一周)；使用Forskolin和BPE的組合時，嗅鞘細胞的的純度卻在2周內迅速下降。這些結果說明Forskolin和不同細胞增殖劑對嗅鞘細胞有不同影響。目前嗅鞘細胞的純化中的主要問題是純化后的細胞隨著細胞的傳代純度不斷下降、活力不斷下降以及移植的嗅鞘細胞的穩定性較差，還沒有一種嗅鞘細胞純化方法能夠獲得純度高且能夠長期存活的嗅鞘細胞。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種嗅鞘細胞的純化培養方法，通過在培養早期階段采用Forskolin增加了部分嗅鞘細胞的貼壁能力，再利用低濃度胰酶消化后，去除其他類型的細胞，對留下的細胞進行培養擴增后，采用正常濃度的胰酶消化后重懸培養，通過上述方法，得到的嗅鞘細胞亞型單一、純度大于98％且細胞能夠長期存活，因此能夠為脊髓損傷的病人提供穩定的種子細胞，為解決嗅鞘細胞移植治療效果不穩定及并發癥多的問題提供一種新的手段。

本發明的第一個目的是提供一種嗅鞘細胞的純化培養方法，包括如下步驟：