[發(fā)明專利]一種雙重響應(yīng)癌細(xì)胞內(nèi)溶酶體粘度和pH的熒光探針、制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010021955.0
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111116539B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫遠(yuǎn)強(qiáng);宋琰;李朝輝;王霞
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: C07D311/88
• 分類號: C07D311/88;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 王紅培

本發(fā)明提供了一種雙重響應(yīng)癌細(xì)胞內(nèi)溶酶體粘度和pH的熒光探針、制備方法和應(yīng)用，該探針分子的結(jié)構(gòu)式如下：，其中R為H、CH₂COOMe或CH₂COOH。該探針的合成只需要幾步就可以完成，且后處理相對簡單；本發(fā)明涉及的探針具有高靈敏性，溶酶體靶向性好的特點。該探針對pH和粘度雙重響應(yīng)，在高粘度條件下熒光增強(qiáng)55倍，可以精準(zhǔn)的靶向溶酶體，在溶酶體的酸性環(huán)境（pH=4?6）中對粘度有響應(yīng)，基于這個特性，可以將該探針應(yīng)用于區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，對于癌癥檢測具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雙重響應(yīng)癌細(xì)胞內(nèi)溶酶體粘度和pH的熒光探針、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥是一種公認(rèn)的頑疾，是細(xì)胞突變后無序分裂生長而形成的惡性腫瘤。正常細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是一個復(fù)雜的過程，不僅表現(xiàn)為細(xì)胞的無序增殖和分裂，還表現(xiàn)為細(xì)胞微環(huán)境的差異。細(xì)胞微環(huán)境是細(xì)胞的重要參數(shù)，與電子傳遞和生物分子相互作用密切相關(guān)。

在眾多參數(shù)中，細(xì)胞黏度是細(xì)胞微環(huán)境中不可缺少的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)黏度的異常變化與包括癌癥在內(nèi)的諸多疾病有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)因為存在多種細(xì)胞器導(dǎo)致黏度分布不均勻，細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的粘度在生物系統(tǒng)中起著非常重要的作用，而不同區(qū)域的粘度變化就會引起相應(yīng)的生理功能的改變或疾病的發(fā)生。為了準(zhǔn)確檢測細(xì)胞黏度的變化，需要選擇特定的細(xì)胞器進(jìn)行檢測。

溶酶體是一種真核細(xì)胞中的酸性亞細(xì)胞器，溶酶體在細(xì)胞遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡和組織重塑等方面發(fā)揮重要作用。溶酶體中具有多種生理性水解酶，作用為分解或代謝細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或大分子，其特征是具有酸性環(huán)境，特異性的粘度，溶酶體粘度的異常變化是溶酶體存在疾病、炎癥甚至癌癥的標(biāo)志。在癌細(xì)胞中，溶酶體粘度相對于正常細(xì)胞要高，且癌細(xì)胞中溶酶體pH（3.8-4.7）低于正常細(xì)胞的pH（4.5-6.0）。通過癌細(xì)胞與正常細(xì)胞中粘度和pH的明顯差異，實現(xiàn)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的區(qū)分。但是利用熒光分子探針對粘度檢測的方法中，大多數(shù)探針只能實現(xiàn)粘度或者pH的單一檢測，受細(xì)胞環(huán)境影響較大，區(qū)分度不高，因此需要開發(fā)靈敏度更高的探針。

識別傳感機(jī)理如下：

在中性條件下探針以亞胺形式存在，可見區(qū)沒有吸收，在高粘度和低粘度條件下長波都沒有熒光。在酸性條件下，胺基被質(zhì)子化，以胺基吡羅紅形式存在，在低粘度環(huán)境下，探針由于苯胺基的旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致熒光很弱或沒有熒光，在高粘度下，苯胺基旋轉(zhuǎn)被抑制，探針顯示很強(qiáng)的熒光，具有高度的靈敏性，并且可以對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過分子設(shè)計，合成了溶酶體靶向的探針，是一種雙重響應(yīng)癌細(xì)胞內(nèi)溶酶體粘度和pH的熒光探針，該探針分子的結(jié)構(gòu)式如下：，其中R為H、CH₂COOMe或CH₂COOH。

R為H時，探針的pKa為4.5，R為CH₂COOMe時，探針的pKa為5.5，R為CH₂COOH時，探針的pKa為9.5。

探針的制備方法為：將吡羅紅酮溶于二氯甲烷中，然后向反應(yīng)液中逐滴加入三氟甲磺酸酐，攪拌反應(yīng)，然后向反應(yīng)液中逐滴加入氨類化合物的二氯甲烷溶液，反應(yīng)液繼續(xù)在室溫下反應(yīng)，反應(yīng)完成后，減壓除去溶劑，柱層析分離得到熒光探針。

所述氨類化合物為苯胺、4-氨基苯乙酸或4-氨基苯乙酸甲酯。

以吡羅紅酮為基準(zhǔn)，三氟甲磺酸酐用量為1.5-3當(dāng)量，氨類化合物用量為1.5-3當(dāng)量；所述反應(yīng)溫度為20-40℃，反應(yīng)時間為0.5-1h。

所述吡羅紅酮的結(jié)構(gòu)式如下：。

由于本發(fā)明探針不僅對酸性環(huán)境有響應(yīng)，還對溶液的高粘度有相應(yīng)，在高粘度條件下熒光增強(qiáng)55倍，可以精準(zhǔn)的靶向溶酶體，因此可以靶向檢測細(xì)胞內(nèi)溶酶體的pH（pH=4-6）以及粘度情況。