[發明專利]一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法在審
| 申請號： | 202010021615.8 | 申請日： | 2020-01-09 |
| 公開（公告）號： | CN111196842A | 公開（公告）日： | 2020-05-26 |
| 發明（設計）人： | 褚洪官;董士尚;秦曉春;溫康寧;王昌輝 | 申請（專利權）人： | 濟南大學 |
| 主分類號： | C07K14/00 | 分類號： | C07K14/00;C12N15/70;C07K1/22 |
| 代理公司： | 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240 | 代理人： | 薛鵬喜 |
| 地址： | 250022 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 轉運 通道 蛋白 膜結構 表達 純化 方法 | ||
1.一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)以BamA基因為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列為引物進行PCR擴增，擴增獲得BamA-POTRA截短體基因；
(2)將步驟(1)擴增獲得的BamA-POTRA截短體基因連入表達載體獲得重組表達載體，然后將重組表達載體轉入原核表達菌株中，獲得工程菌，將工程菌培養至菌液A600OD值為0.6-0.8時，加入誘導劑繼續培養16-18h；
(3)取加入誘導劑培養后的菌液，離心收集菌體，用收菌緩沖液懸浮菌體；破碎菌體的細胞，離心收集上清液；將上清液進行鎳離子親和層析柱初步分離，再經過肝素親和層析上樣、洗脫并收集在出峰范圍內的洗脫液樣品，得到純化后的BamA-POTRA截短體蛋白。
2.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述PCR擴增的條件為：94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共32個循環；最后72℃保溫10min。
3.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(1)中，所述BamA-POTRA截短體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(2)中，所述表達載體為PET-28a質粒。
5.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(2)中，所述原核表達菌株為BL21(DE3)。
6.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(2)中，所述誘導劑為IPTG，誘導劑加入后的終濃度為0.5mM。
7.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述收菌緩沖液中含有200mM NaCl、20mM HepeS；所述收菌緩沖液的pH為7.0。
8.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(3)中，將上清液進行鎳離子親和層析柱初步分離的條件為：分別用25mM、50mM咪唑洗脫；上樣的緩沖液是20mM Hepes，200mM NaCl，pH為7.0；洗脫的緩沖液是20mM Hepes，1M NaCl，pH為7.0。
9.根據權利要求1所述的表達純化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述BamA-POTRA截短體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
10.由權利要求1-9任一項所述的表達純化方法制備的BamA-POTRA截短體蛋白在BamA蛋白結構解析中的用途。
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