[發明專利]一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法

在審

• 申請號: 202010021615.8
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111196842A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 褚洪官;董士尚;秦曉春;溫康寧;王昌輝
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/70;C07K1/22
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法，屬于生物技術領域。本發明通過對外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域進行截短處理，選擇BamA?POTRA的30?273這一段氨基酸序列作為截短體，其包含了3個POTRA，涵蓋了BamA蛋白非跨膜結構域的主要功能區域；而且，將編碼該截短體的基因序列與pET?28a質粒連接，并進行原核表達，可以在體外表達大量高純度的目的蛋白，極大提高了BamA蛋白的非跨膜結構域的體外表達效率，而且所表達的目的蛋白的純度高，可達90％以上；本發明通過高純度的BamA?POTRA截短體蛋白的體外表達，對BamA蛋白的三維結構解析具有十分重要的意義。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法。

背景技術

跨膜的外膜蛋白幾乎是β-桶狀結構，通常直接稱為OMPs(Outer MembraneProtein)。OMPs是由8-24個偶數反向平行的β-折疊通過相鄰的氫鍵形成的β-桶狀結構蛋白，β-折疊主要是由面向膜磷脂的疏水性氨基酸和面向桶狀結構內層的親水性氨基酸構成的雙性結構，各β-折疊之間由面向細胞外的長環和面向周質空間的短環連接。OMPs折疊組裝輔助因子BAM復合體對OMPs體內折疊至關重要，體外折疊實驗結果表明BAM復合體能提高OMPs的折疊效率。

BamA(也被稱為Omp85)是BAM復合體中最重要的核心組成部分，具有高度的保守性，它的缺失是致死的。BamA由C-末端整合到外膜的β-桶狀結構域和N-末端面向周質空間的5個POTRA(Polypeptide Transport-Associated)結構域組成。POTRA結構域屬于外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域，各POTRA之間的連接結構具有極強的柔性，從而使得它們具有移動性和延伸性，可作為BamA與BAM復合體的其它單體的結合位點，還可通過β-片層結構間的相互作用特異性結合處于未折疊狀態的OMPs。

近年來，對BamA蛋白的功能研究取得了較大的進展，但由于BamA蛋白的非跨膜結構域在體外表達的效率非常低，并且純化困難，成為制約BamA蛋白結構解析的難點所在。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法。本發明通過構建伯氏疏螺旋體BamA-POTRA的截短體，極大提高了BamA蛋白的非跨膜結構域的體外表達效率，而且所表達的目的蛋白的純度高，有利于對BamA蛋白進行結構解析。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種外膜轉運通道蛋白的非跨膜結構域的表達純化方法，包括以下步驟：

(1)以BamA基因為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列為引物進行PCR擴增，擴增獲得BamA-POTRA截短體基因；

(2)將步驟(1)擴增獲得的BamA-POTRA截短體基因連入表達載體獲得重組表達載體，然后將重組表達載體轉入原核表達菌株中，獲得工程菌，將工程菌培養至菌液A600OD值為0.6-0.8時，加入誘導劑繼續培養16-18h；

(3)取加入誘導劑培養后的菌液，離心收集菌體，用收菌緩沖液懸浮菌體；破碎菌體的細胞，離心收集上清液；將上清液進行鎳離子親和層析柱初步分離，再經過肝素親和層析上樣、洗脫并收集在出峰范圍內的洗脫液樣品，得到純化后的BamA-POTRA截短體蛋白。

優選的，步驟(1)中，所述PCR擴增的條件為：94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共32個循環；最后72℃保溫10min。

優選的，步驟(1)中，所述BamA-POTRA截短體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。