[發明專利]一種多重熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202010021461.2
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN113088569A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 高貴麗;張天賦
• 申請（專利權）人: 北京中因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京悅和知識產權代理有限公司 11714
• 代理人: 司麗春

本發明實施例涉及一種多重熒光定量PCR試劑盒。其特征在于：包括：第一反應體系試劑、第二反應體系試劑和第三反應體系試劑，第一反應體系試劑至第三反應體系試劑中包括：擴增引物和探針序列。本發明實施例中使用了多種探針的組合形式進行多重熒光定量PCR，在不影響檢測結果的同時，減少了PCR反應的次數。

技術領域

本發明涉及檢測分析領域，尤其涉及一種多重熒光定量PCR試劑盒。

背景技術

角膜營養不良是臨床上一系列與家族遺傳有關的原發性、進行性及致盲性角膜病變的總稱，其發病率約為1/1000。由TGFBI基因R124C突變引起的顆粒狀營養不良I型、由TGFBI基因R124H突變引起的顆粒狀營養不良II型、由TGFBI基因R124L突變引起的Reis-Bücklers角膜營養不良、由TGFBI基因R555W突變引起的顆粒狀營養不良I型、由TGFBI基因R555Q突變引起的Thiel-Behnke角膜營養不良均是我國人群中最為常見的角膜營養不良。但這5種基因突變引起的角膜營養不良患者在接受治療性屈光手術時，部分存在較大的不良反應，國內外先后報道了多例由LASIK術后引起這些角膜營養不良患者的角膜混濁加劇、矯正視力明顯下降的病歷。因此通過基因檢測技術來篩查這類人群能為醫生決策治療手段提供參考。

現有技術方案中，可以針對上述任意一個突變位點設計特異性熒光探針及一對擴增引物，再找一個內參基因一般是GAPDH，通過野生型探針的Ct值和突變型探針Ct值的差值，判斷基因型。但這種方案中，一次只能檢測一個突變位點，并且不是所有突變位點的探針都能混在一起做多重反應，有些突變位點即使探針距離很遠，但也會相互影響。

現有技術方案中，還可以針對一個突變位點設計特異性突變阻滯擴增系統(ARMS)引物，結合通用型熒光探針，再找一個內參基因一般是GAPDH，根據特異性引物擴增產物探針檢測的Ct值與內參檢測的Ct值差值進行基因型判斷。對于此種方法可以做成多重反應，但多重反應受位點影響較大，對于同一SNP位點的多種突變、相鄰SNP位點的檢測不能在同一反應中進行檢測。本發明涉及的R124H、R124L為同一SNP位點突變，R124C與R124H、R124L為相鄰SNP位點突變；R555W與R555Q也為相鄰SNP位點突變，不適合該種方法。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發明內容

發明目的

本發明的目的在于提供一種多重熒光定量PCR試劑盒，其包括：第一反應體系試劑、第二反應體系試劑和第三反應體系試劑，其中：

所述第一反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的擴增引物、SEQ IDNO.2所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探針、SEQ ID NO.4所示序列的探針和SEQ ID NO.5所示序列的探針；

所述第二反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.7所示序列的擴增引物、如SEQ IDNO.8所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.9所示序列的探針、SEQ ID NO.10所示序列的探針和SEQ ID NO.11所示序列的探針；

所述第三反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的擴增引物、SEQ IDNO.2所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探針和SEQ ID NO.6所示序列的探針；

第一反應體系試劑至第三反應體系試劑中，各個探針序列的5’和3’端分別與熒光基團和淬滅基團相連，其中：同一反應體系試劑中的各個探針序列5’端的熒光基團各不相同，所述熒光基團選自：FAM、CY5或VIC。