[發明專利]一種多重熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202010021461.2
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN113088569A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 高貴麗;張天賦
• 申請（專利權）人: 北京中因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京悅和知識產權代理有限公司 11714
• 代理人: 司麗春

1.一種多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：包括：第一反應體系試劑、第二反應體系試劑和第三反應體系試劑，其中：

所述第一反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.2所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探針、SEQ ID NO.4所示序列的探針和SEQ IDNO.5所示序列的探針；

所述第二反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.7所示序列的擴增引物、如SEQ ID NO.8所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.9所示序列的探針、SEQ ID NO.10所示序列的探針和SEQID NO.11所示序列的探針；

所述第三反應體系試劑中包括：如SEQ ID NO.1所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.2所示序列的擴增引物、SEQ ID NO.3所示序列的探針和SEQ ID NO.6所示序列的探針；

第一反應體系試劑至第三反應體系試劑中，各個探針序列的5’和3’端分別與熒光基團和淬滅基團相連，其中：同一反應體系試劑中的各個探針序列5’端的熒光基團各不相同，所述熒光基團選自：FAM、CY5或VIC。

2.根據權利要求1所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述第三反應體系試劑中還包括：如SEQ ID NO.12所示序列的擴增引物、如SEQ ID NO.13所示序列的擴增引物和SEQ ID NO.14所示序列的探針。

3.根據權利要求2所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：SEQ ID NO.14所示序列的探針的5’和3’端分別與熒光基團和淬滅基團相連，其中：熒光基團選自：FAM、CY5或VIC。

4.根據權利要求1或3所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：各個探針序列的3’端包括MGB淬滅基團。

5.根據權利要求1所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：多重熒光定量PCR試劑盒中還包括：用于熒光定量PCR的其他試劑。

6.根據權利要求1所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：采用該多重熒光定量PCR試劑盒檢測的方法包括以下步驟：1)提取樣本中的DNA，將其作為DNA模板，DNA濃度不低于10ng/ul，DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0之間；2)將DNA模板分別加入第一反應體系試劑、第二反應體系試劑、第三反應體系試劑中；3)進行熒光定量PCR擴增反應；4)判斷是否發生突變。

7.根據權利要求6所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所述樣本為血液樣本或口腔上皮細胞樣本。

8.根據權利要求6所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：

步驟3)中熒光定量PCR擴增的反應體系為總體積為20μl如下體系：

9.根據權利要求6所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：步驟3)中PCR擴增的反應條件如下：

10.根據權利要求6所述的多重熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：步驟4)中判斷是否發生突變的方法包括以下步驟：

針對反應體系1中的結果判斷：

R124H探針ct值35時，判斷反應體系中沒有R124H突變；R124L探針ct值35時，判斷反應體系中沒有R124L突變；如果R124H探針ct值≤35或R124L探針ct值≤35，按照以下方法進行判斷：

(1)R124WT探針ct值-R124H探針ct值的差值＞4、R124L探針ct值-R124WT探針ct值＞5，則判斷此樣本為R124H純合突變、R124L未突變樣本；

(2)0≤R124H探針ct值-R124WT探針ct值的差值≤3.5、R124L探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124H雜合突變、R124L未突變樣本；

(3)R124H探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5、R124L探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124H未突變、R124L未突變樣本；

(4)R124WT探針ct值-R124L探針ct值的差值＞4、R124H探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124L純合突變、R124H未突變型樣本；

(5)0≤R124L探針ct值-R124WT探針ct值的差值≤3.5、R124H探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124L雜合突變、R124H未突變樣本；

針對反應體系2中的結果判斷：

R555Q探針ct值35時，判斷反應體系中沒有R555Q突變；R555W探針ct值35時，判斷反應體系中沒有R555W突變；如果R555Q探針ct值≤35或R555W探針ct值≤35，按照以下方法進行判斷：

(1)R555WT探針ct值-R555Q探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R555Q純合突變樣本；

(2)-3≤R555Q探針ct值-R555WT探針ct值的差值≤3，則判斷此樣本為R555Q雜合突變樣本；

(3)R555Q探針ct值-R555WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R555Q未突變樣本；

(4)R555WT探針ct值-R555W探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R555W純合突變樣本；

(5)-3≤R555W探針ct值-R555WT探針ct值的差值≤3，則判斷此樣本為R555W雜合突變樣本；

(6)R555W探針ct值-R555WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R555W未突變樣本；

針對反應體系3中的結果判斷：

R124C探針ct值35時，判斷反應體系中沒有R124C突變；如果R124C探針ct值≤35,按照以下方法進行判斷：

(1)R124WT探針ct值-R124C探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124C純合突變樣本；

(2)0≤R124C探針ct值-R124WT探針ct值的差值≤3.5，則判斷此樣本為R124C雜合突變樣本；

(3)R124C探針ct值-R124WT探針ct值的差值＞5，則判斷此樣本為R124C未突變樣本。