[發明專利]生物分子完全免固定的紙基電化學傳感器的構建

在審

• 申請號: 202010021198.7
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111024793A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 于京華;史慧慧;王衍虎
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/30;G01N27/48;C12Q1/6825
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 趙鳳

本發明公開了一種完全免固定高效檢測miRNA的分析策略。本方法首先在微流控紙芯片原位生長金納米，隨后通過羰基和金的相互作用將葫蘆[7]脲固定在紙工作電極上。由于帶負電荷的磷酸二酯主鏈與葫蘆[7]脲的負羰基之間的排斥作用，亞甲基藍標記的探針幾乎不能與葫蘆[7]脲形成配合物，因此不能有效地產生電化學響應。當目標物和外切酶加入到溶液后，亞甲基藍標記的探針被外切酶剪切釋放亞甲基藍標記的單核苷酸。由于葫蘆[7]脲的超分子識別能力和單核苷酸具有超低的負電荷，亞甲基藍標記的單核苷酸被葫蘆[7]脲捕獲產生可檢測的電信號實現對目標物的量化檢測。本方法不具有復雜的材料生長和生物標記過程，省時省力，操作簡單，檢測快速，為其他疾病相關生物標記物的小型化檢測提供一個途徑。

技術領域

本發明涉及納米材料技術，生物標記技術及紙芯片技術領域，更具體的說是生物分子完全免固定的紙基電化學傳感器的構建。

背景技術

作為一種小的非編碼的RNA分子，miRNA在細胞增值、遺傳、基因分化等生物學過程中具有重要的作用。一些miRNA還與人類癌癥的發生、病毒感染和腫瘤的治療相關，是早期疾病的診斷、發病機制的研究的重要生物標志物。到目前為止，許多分析方法-化學發光、電致化學發光、光電化學、電化學-已經實現了對miRNA的檢測。其中，電化學傳感由于靈敏度高、選擇性好、易于微型化等優點收到廣泛關注。

對于大多數的電化學傳感器，電化學材料和生物識別探針通過化學或物理作用固定在電極的表面，通過DNA結構的變化或電極表面電性質的變化實現對目標物的檢測。固定過程存在良好的可重復性、靈敏度高等優點，也存在許多缺點，例如耗費時間長、操作復雜、用于連接基團的試劑增加了成本、固定條件的最優化、電極表面空間位阻可能導致探針幾何變化等。因此，開發無固定化的電化學傳感方法實現簡單、快速、低成本的生物分析是最為理想的方法。

發明內容

針對現有技術不足，本發明提供了生物分子完全免固定的紙基電化學傳感器的構建。本發明通過以下措施實現：

（1）在計算機上用Adobe illustrator CS4設計紙芯片的圖案，將設計好的打印圖案通過蠟打印機打印在A4色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在100 ℃加熱60 s形成疏水區域和親水的工作區域；

（2）用絲網印刷技術在步驟（1）中獲得的紙芯片上印刷三電極體系（碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極）；

（3）利用原位還原法在碳電極的工作區域生長金納米，其具體步驟為：首先，20 μL金納米粒子溶液滴涂在電極表面，在室溫下干燥，此過程重復三次，隨后稱取0.013 g鹽酸羥胺溶解于1 mL去離子水中，加入1 mL質量分數1 %的氯金酸，充分搖晃后，量取20 μL滴在電極表面，室溫下干燥即可，最后，將電極在1 mM葫蘆[7]脲中培育1 h;

（4）取30 μL 10 μM亞甲基藍標記的DNA 和20 μL 不同濃度的miRNA溶解在37 μLTris-HCl 緩沖液中，在37 ℃下培育2 h，然后將3 μL T7 核酸外切酶 (2 U/μL) 和 10 μL1× NEB 緩沖液加入到上述溶液中，在37 ℃下培育1 h;

（5）將步驟（4）中獲得的溶液添加到磷酸鹽緩沖溶液中，然后將上述溶液滴加到步驟（3）的電極的工作區域，利用三電極系統通過微分脈沖伏安法進行電化學信號檢測。

本發明所述的金種子溶液合成過程是：取90 mL二次水置于三口燒瓶中并加熱到90 ℃，然后加入0.5 - 0.8 mL質量分數為1 %的氯金酸溶液，持續加熱至96 ℃，反應1 min后，加入2.5 mL質量分數為1 %的檸檬酸鈉，在攪拌下反應15 min，得到金納米粒子溶液。

本發明所述的1×NEB 緩沖液配制過程是取20 mM Tris-HAc緩沖液，依次加入0.2145g四水乙酸鎂、0.49 g醋酸鉀、0.0154 g的二硫蘇糖醇，隨后用醋酸調節溶液pH到7.9，定容到100 mL。