[發(fā)明專利]檢測Lasiodiplodia paraphysoides的LAMP引物及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010020988.3
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111088386A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張英;王宇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京市京大律師事務(wù)所 11321
• 代理人: 李洪群

本發(fā)明提供一套檢測藍(lán)莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)的LAMP引物及試劑盒。所述LAMP引物包括外側(cè)正、反向引物以及內(nèi)側(cè)正、反向引物，它們的核苷酸序列如SEQ ID NO：1?4所示。本發(fā)明將LAMP引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于Lasiodiplodia paraphysoides病菌的快速檢測，可從發(fā)病植物組織及苗木中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準(zhǔn)確地檢測出該致病菌。該方法的特異性、靈敏度及可重復(fù)性均較常規(guī)PCR方法更高，對Lasiodiplodia paraphysoides早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時(shí)可避免高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種檢測Lasiodiplodiaparaphysoides的LAMP引物及試劑盒。

背景技術(shù)

葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaericeae)侵染引起的藍(lán)莓莖潰瘍病(BlueberryStem Blight)，目前在我國主要藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)已有發(fā)生報(bào)道，對中國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來嚴(yán)重危害。該菌從藍(lán)莓植株的傷口或自然孔口進(jìn)行侵染，導(dǎo)致皮層和韌皮部的枯死在田間引起藍(lán)莓枝條枯萎、木質(zhì)部壞死及植株死亡等癥狀。目前，葡萄座腔菌科中已有多種能引發(fā)此病害(Botryosphaeria cortices，Botryosphaeria dothidea，F(xiàn)usicoccum aesculin，Lasiodiplodia chinesis，Lasiodiplodia paraphysoides，Lasiodiplodia theobromae，Lasiodiplodia vaccinii，Neofusicoccum arbuti，Neofusicoccum austral，Neofusicoccum parvum，Neofusicoccum ribis)，其中Lasiodiplodia paraphysoides是一種強(qiáng)致病菌，可在藍(lán)莓枝條表面形成紅褐色病斑，引起維管束壞死和整枝枯萎死亡，該菌主要在枝條病斑內(nèi)越冬，在適宜條件下產(chǎn)生分生孢子，借助通過自然孔口或機(jī)械傷口侵入田間植株，侵染后，菌絲迅速擴(kuò)展到維管組織，通過細(xì)胞間隙橫向發(fā)展，最終，在愈傷組織、皮層、木質(zhì)部、管胞或?qū)Ч艿雀鞣N類型的細(xì)胞中定殖。該菌有潛伏侵染的特性，通常作為腐生菌在土壤中或植物內(nèi)生菌在健康的植株中存在，當(dāng)遇到高溫、積水、風(fēng)害等逆境條件時(shí)便開始侵染植株。因此，對該類病菌的初侵染源早期進(jìn)行適時(shí)監(jiān)控，對于該病害的防控有重要意義，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時(shí)才實(shí)施，忽視了對初侵染源早期適時(shí)采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。

普通PCR技術(shù)需要精密變溫設(shè)備和高級復(fù)雜的分析儀器，或者對操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求比較高，且反應(yīng)時(shí)間長，不利于基層推廣。自環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對病毒、細(xì)菌、寄生蟲、菌物等病原菌的檢測研究。LAMP技術(shù)作為一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)速度快、設(shè)備簡單，而且結(jié)果易于鑒定，尤其適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)。目前尚未見利用LAMP技術(shù)檢測藍(lán)莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測藍(lán)莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)的LAMP引物及試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供基于LAMP技術(shù)的藍(lán)莓枝枯病病菌(Lasiodiplodiaparaphysoides)檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測藍(lán)莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)的LAMP引物，所述LAMP引物為(SEQ ID NO：1-4)：

外側(cè)正向引物F3：5’-TCCGTCCCTCGGACAAG-3’；