[發明專利]檢測Lasiodiplodia paraphysoides的LAMP引物及試劑盒

在審

• 申請號: 202010020988.3
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111088386A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 張英;王宇
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 李洪群

1.用于檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物為：

外側正向引物F3：5'-TCCGTCCCTCGGACAAG-3’；

外側反向引物B3：5'-TCACCGGGGACACCCT-3’；

內側正向引物FIP：5'-TCCACACGACCGACGGGGACCCCTCCAGGACGTCTAC-3’；

內側反向引物BIP：5'-GGTGTTATCAAGGCGGGCATGGCATCTCGACGGACTTGACC-3’。

2.含有權利要求1所述LAMP引物的檢測試劑或試劑盒。

3.藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1所述LAMP引物，還包含dNTPs、BstDNA聚合酶、反應緩沖液、標準陽性模板中的至少一種。

4.權利要求1所述LAMP引物、權利要求2所述檢測試劑或試劑盒，或權利要求3所述檢測試劑盒在檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)中的應用。

5.藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權利要求1所述LAMP引物進行LAMP擴增反應；

3)擴增結果判定。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所用反應體系為：

ddH₂O補足至25μl；

其中，所述反應體系中引物FIP和BIP按等量加入，引物F3和B3按等量加入，且引物FIP、BIP與引物F3、B3的總質量比為8∶1。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所用反應條件為：61～65℃50～90分鐘。

8.根據權利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟3)采用如下①～③中的任一種方法進行擴增結果判定：

①熒光染色法：向擴增產物中加入染料SYBR Green I，進行顯色反應，若反應體系由橙色變為綠色，表明待測樣品中含有藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)；或者，在擴增反應前向反應體系中加入鈣黃綠素，擴增反應結束后，在紫外燈照射下反應體系顯示熒光綠色，表明待測樣品中含有藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)；或者，在擴增反應前向反應體系中加入羥基萘酚藍，擴增反應結束后，若反應體系由紫色變為天藍色，表明待測樣品中含有藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)；

②瓊脂糖凝膠電泳法：若擴增產物在瓊脂糖凝膠上呈現特征性梯狀條帶，表明待測樣品中含有藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia paraphysoides)；

③焦磷酸鎂濁度檢測法：通過肉眼觀察反應后的渾濁情況來判斷是否發生了LAMP擴增反應，或利用濁度儀檢測其在400nm處的吸光度，實現實時定量檢測。