[發(fā)明專利]一種NK細(xì)胞體外大規(guī)模誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010020487.5
• 申請日: 2020-01-09
• 公開（公告）號: CN111117960A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳勇
• 申請（專利權(quán)）人: 上海奕杉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京中索知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11640
• 代理人: 趙登陽

本發(fā)明公開了一種NK細(xì)胞體外大規(guī)模誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：采集外周血并分離外周血單個核細(xì)胞；將細(xì)胞接種至包被CD16和CD137L激活抗體的培養(yǎng)瓶中；加入無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，使細(xì)胞密度為2?4*106個/ml，此時種板為day0，將誘導(dǎo)因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)4d后加入補充無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，將激活因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)9d后加入補充無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，將擴增因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中。本發(fā)明可以達(dá)到完全無血清培養(yǎng)，操作方案操作較為簡單，成本較低，得到的NK細(xì)胞在細(xì)胞活性，純度，細(xì)胞數(shù)量以及殺傷活性方面具有顯著優(yōu)勢。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種NK細(xì)胞體外大規(guī)模誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞，又叫自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NK)，是機體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞。現(xiàn)在人們由于不良生活習(xí)慣、工作壓力、環(huán)境因素等的變化，伴隨著機體免疫力下降，NK細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，活性減弱，導(dǎo)致了“幸存”下來的癌細(xì)胞越來越多，而且會慢慢適應(yīng)機體的免疫環(huán)境，并開始急劇增長。強化自身軟弱的NK細(xì)胞，提高機體NK細(xì)胞數(shù)量，增強其活性，清除機體內(nèi)衰老和癌變細(xì)胞，使其回到年輕健康的狀態(tài)，這就是“NK免疫療法”，而如何在體外獲得大量活化的NK細(xì)胞是臨床應(yīng)用NK細(xì)胞免疫療法的關(guān)鍵，日本在該行業(yè)走在前列，目前國內(nèi)大部分醫(yī)療或美容機構(gòu)采用日本技術(shù)在體外擴增NK，這也是NK免疫療法收費昂貴的原因之一。國內(nèi)NK擴增技術(shù)培養(yǎng)的效果均遜于日本技術(shù)，體外培養(yǎng)出的活化NK細(xì)胞量不夠大，不夠高效。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種NK細(xì)胞體外大規(guī)模誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法。

本發(fā)明提出的一種NK細(xì)胞體外大規(guī)模誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

S1：采集外周血并分離外周血單個核細(xì)胞；

S2：將細(xì)胞接種至包被CD16和CD137L激活抗體的培養(yǎng)瓶中；

S3：加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，使細(xì)胞密度為2-4*106個/ml，此時種板為day0，將誘導(dǎo)因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中即配置成誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

S4：培養(yǎng)4d后加入激活培養(yǎng)基，將激活因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中即配置成激活培養(yǎng)基；

S5：培養(yǎng)9d后加入擴增培養(yǎng)基，將擴增因子加入到無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中即配置成擴增培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)因子記為NKGrow3，NKGrow4和NKGrow5，所述NKGrow3為細(xì)胞因子IL-2，濃度為10-100ng/ml，所述NKGrow4為細(xì)胞因子IL18，濃度為10-50ng/ml，所述NKGrow5為細(xì)胞因子IL15,濃度為10-100ng/ml。

優(yōu)選地，所述激活因子記為NKGrow6和NKGrow7，所述NKGrow6為細(xì)胞因子IL-15，濃度為10-100ng/ml，所述NKGrow7為細(xì)胞因子IL21，濃度為10-50ng/ml。

優(yōu)選地，所述擴增因子記為NKGrow8，所述NKGrow8為細(xì)胞因子IL-2，濃度為10-100ng/ml。

優(yōu)選地，所述NKGrow3為細(xì)胞因子IL-2，濃度為50ng/ml，所述NKGrow4為細(xì)胞因子IL18，濃度為25ng/ml，所述NKGrow5為細(xì)胞因子IL15,濃度為50ng/ml。

優(yōu)選地，所述NKGrow6為細(xì)胞因子IL-15，濃度為50ng/ml，所述NKGrow7為細(xì)胞因子IL21，濃度為25ng/ml。

優(yōu)選地，所述NKGrow8為細(xì)胞因子IL-2，濃度為50ng/ml。

優(yōu)選地，所述無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基為AlyS505NK培養(yǎng)基或XVIVO500培養(yǎng)基。