[發(fā)明專(zhuān)利]一種GM-CSF敲低的T細(xì)胞及其用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010019264.7
• 申請(qǐng)日: 2020-01-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113088540A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王月英;王文博;尚思岐
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N5/10;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/02
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;徐迅

本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)染由該表達(dá)載體的嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體表達(dá)載體有編碼嵌合抗原受體的序列以及編碼可敲低人GM?CSF的shRNA的序列。該嵌合抗原受體T細(xì)胞在GM?CSF的表達(dá)水平敲低的同時(shí)，具有高效的嵌合抗原受體表達(dá)和殺腫瘤活力，有望降低嵌合抗原受體T細(xì)胞治療過(guò)程中所產(chǎn)生的CRS等副作用，應(yīng)用廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種經(jīng)過(guò)基因修飾的T細(xì)胞，尤其是GM-CSF敲低的嵌合抗原受體T細(xì)胞及 其用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor-T cells,CAR-T)療法，是指經(jīng)基因 工程改造后使T細(xì)胞特異性地靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫治療手段，可用于治療血液系統(tǒng) 及其它系統(tǒng)的復(fù)發(fā)難治性惡性腫瘤。目前臨床研究和應(yīng)用最廣泛的CAR-T細(xì)胞療法是使用抗CD19-CART細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治性CD19⁺B細(xì)胞惡性腫瘤，其總緩解率可以達(dá)到50- 90％，其中部分患者可達(dá)到持續(xù)的疾病緩解。諾華公司的Kymriah是全球首個(gè)獲批的CAR- T治療產(chǎn)品，用于治療兒童及青少年患者的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和成人復(fù)發(fā)或難 治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)。

然而，CAR-T細(xì)胞治療中會(huì)出現(xiàn)一些與傳統(tǒng)化療及小分子靶向藥物治療中截然不同 的特征性的毒副反應(yīng)，極大的影響了CAR-T細(xì)胞療法普及和應(yīng)用。CAR-T細(xì)胞輸注后最常見(jiàn)的兩種毒副反應(yīng)包括細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS，主要癥狀為高熱、低血壓、缺氧和 /或多器官毒性)和CART細(xì)胞相關(guān)性腦病綜合征(CRES，主要表現(xiàn)為意識(shí)模糊、譫妄、 偶爾伴癇性發(fā)作及腦水腫)。這些毒副反應(yīng)的發(fā)生率在37％到93％，雖然在大多數(shù)患者 中是可控的，但少數(shù)患者需要接受重癥監(jiān)護(hù)治療，也有極少數(shù)患者因此死亡。盡管已有大 量針對(duì)細(xì)胞治療毒副反應(yīng)機(jī)制的研究，但由于涉及諸多的免疫細(xì)胞及炎癥因子間的復(fù)雜 作用網(wǎng)絡(luò)，CRS/CRES的完整機(jī)制及預(yù)防手段仍是一項(xiàng)科學(xué)難題。因此有必要追溯到細(xì)胞 因子分泌的源頭來(lái)預(yù)防CRS/CRES的發(fā)生。現(xiàn)在臨床上常規(guī)使用IL-6受體阻斷藥物托珠 單抗(Tocilizumab)來(lái)控制CRS，如果無(wú)效或者出現(xiàn)神經(jīng)毒性反應(yīng)則建議應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。 但是毒副反應(yīng)的存在仍不可避免的增加患者的用藥負(fù)擔(dān)和住院時(shí)間，使部分患者必須接 受重癥監(jiān)護(hù)及治療，甚至在少數(shù)患者引起難以控制的毒性反應(yīng)。很多臨床研究發(fā)現(xiàn)，除了 IL-6以外，在輸注CAR-T細(xì)胞后的患者血清中升高的炎性因子還包括sIL-6R、sIL2Rα、 IFN-γ、GM-CSF、MCP-1和IL-1β等。已有研究表明CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸并活 化后先分泌如GM-CSF和IFN-γ等促炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子之后再與單核細(xì)胞等 免疫細(xì)胞接觸，從而促使單核細(xì)胞分泌大量的致病性炎癥因子如IL-6及IL-1。據(jù)報(bào)道， CAR-T誘導(dǎo)的髓系細(xì)胞分泌IL-6和IL-1是CRS發(fā)生的主要原因。而CAR-T細(xì)胞分泌的GM-CSF是髓系細(xì)胞激活的主要因子。

已經(jīng)有研究團(tuán)隊(duì)使用TALEN或CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CAR-T細(xì)胞中的GM-CSF基 因，從而降低CAR-T細(xì)胞GM-CSF分泌(2018，Sachdeva及Sterner)。他們的研究結(jié)果 表明在CAR-T細(xì)胞中敲除GM-CSF可以在不損害CAR-T細(xì)胞的功能的同時(shí)，預(yù)防CRS 反應(yīng)發(fā)生。但是他們采用的技術(shù)手段要求事先在T細(xì)胞中電轉(zhuǎn)編碼GM-CSF TALEN臂 的mRNA，或是在制備CAR-T細(xì)胞的同時(shí)額外轉(zhuǎn)染lentiCRISPRv2質(zhì)粒包裝的慢病毒。 這些額外的流程不僅增加制備的難度和費(fèi)用，還會(huì)損害CAR-T細(xì)胞的活力和增值能力。 另外，轉(zhuǎn)染效率的不確定性也使得GM-CSF敲低的效率變得難以預(yù)測(cè)。因此，我們需要 一種更加簡(jiǎn)便、有效的技術(shù)手段來(lái)制備GM-CSF低表達(dá)型CAR-T細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種新型GM-CSF敲低型CAR表達(dá)載體，將用于敲低GM-CSF的短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)框組合到CAR表達(dá)載體上，來(lái)實(shí) 現(xiàn)CAR結(jié)構(gòu)和shRNA的共表達(dá)。從而在不增加任何用藥負(fù)擔(dān)和額外制備流程的前提下， 同步表達(dá)CAR并降低CAR-T細(xì)胞活化后GM-CSF表達(dá)。