[發明專利]一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法

在審

• 申請號: 202010018273.4
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111117965A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 毛琦淇;張謝;仇騫慧;李宏
• 申請（專利權）人: 寧波市醫療中心李惠利醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 解敬文;施艷榮

本發明一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，包括以下步驟：振蕩消化腫瘤組織，制備混合細胞懸液；將混合細胞懸液沿離心管壁緩慢加入到胎牛血清上層，加完后放置到培養箱中靜置；時間差異消化貼壁細胞，獲得純度高的原代腫瘤細胞。本發明提供的高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，采用振蕩器對組織團塊進行消化，可加速組織團塊分散成單個細胞懸液，減少混合消化酶對細胞膜的破壞，即提高接種細胞的存活率，又能保護原代細胞膜的特性，利用胎牛血清靜置沉淀加時間差異胰酶消化實現原代腫瘤細胞的純化，可將腫瘤細胞和其他非腫瘤細胞進行最大程度的分離，純化效率高，節約純化時間，既簡單又實用，為應用到臨床病人的個體化治療提供重要的技術支持。

技術領域

本發明屬于原代腫瘤細胞純化技術領域，具體涉及一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法。

背景技術

當今社會，癌癥作為威脅人類健康的重要疾病之一，其發病率和死亡率高居不下。由于腫瘤細胞的特異性表征很難尋找，在現有的科學研究中還未能找到一種針對癌癥的特異性治療藥物。

原代腫瘤細胞培養方法，指在無菌條件下，從動物體內提取組織，通過體外模擬體內生理環境使其生存和生長并維持其結構以及功能的方法，其作為癌癥體外研究的重要手段，可為腫瘤的深入研究及治療提供有效的細胞來源，與體內研究相輔相成。若能從病人腫瘤組織中純化出原代腫瘤細胞并通過藥物篩選出對該原代腫瘤細胞殺傷力最強的藥物，再用于該病人的治療，將大大提高該病人的癌癥治療率。

1951年人類第一株腫瘤細胞Hela(宮頸癌)的建立對癌癥的研究產生了重大的影響，極大促進了各種癌癥治療方法的發展。但是，現有的腫瘤細胞原代培養成功率并不高，且耗費時間長，待腫瘤細胞穩定生長時，已失去了很多該腫瘤組織所特有的生物學特性，因此，我們仍需進一步探討與研究如何縮短原代腫瘤細胞純化及培養時間，保證其形狀與體內相似，為研究腫瘤發生、發展及轉移機制以及抗腫瘤藥物敏感性的檢測甚至腫瘤的基因治療提供一個有效的平臺。

盡管建立腫瘤細胞系的技術方法在不斷改進，但是仍沒有一種高效率、規范化的建立方法，現有的細胞純化方法主要分為兩種：自然純化和人工純化。自然純化作為最早的一種純化方式，利用某一種類細胞的增殖優勢，在長期傳代過程中自然淘汰劣勢細胞，僅留下生長旺盛的細胞以實現細胞純化，但是此方法花費時間長，留下來的幾乎都是成纖維細胞，僅有惡變的腫瘤細胞或突變的細胞能通過此方法保留下來，而且需要不斷純化才能達到建立細胞系的標準，培養時間過長會影響原代腫瘤細胞的細胞學特性，影響其生物學特性的研究。人工純化借助人為技術創造對某一種類細胞生長有利的生存環境，實現細胞的純化，目前主要通過以下幾種方法來實現：酶消化法、機械刮除法和克隆法等，但都存在以下不足：酶消化法通常使用胰蛋白酶，該酶作用于精氨酸及賴氨酸組成的肽鍵，消化能力非常強，但是對細胞膜的傷害較大，大大影響腫瘤細胞膜表面的生物學特性的研究；機械刮除法是在顯微鏡下將腫瘤細胞團以外的成纖維細胞團及其他細胞團直接刮除掉，但是該方法對操作人員的工作經驗有較高要求，需要操作人員對細胞的生長有深入的研究，并能通過經驗判斷不同的細胞群，人為誤差較大；克隆法將混合細胞分成若干細胞懸液，通過對不同克隆細胞群的檢驗得到實驗所需的腫瘤細胞克隆群，該方法得到的細胞克隆非常純，但是耗費時間長，在長期的培養過程中，腫瘤細胞的生物學特性與剛離體的腫瘤細胞差異明顯，影響研究的準確性。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術手段為：

一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，包括以下步驟：

步驟一、制備混合細胞懸液

取新鮮離體的腫瘤組織，剪碎，加入含膠原酶Ⅰ的DMEM不完全培養基，將混合液轉移到離心管中，振蕩消化腫瘤細胞，隨后離心3-5次，離心后棄上清液；使用胰蛋白酶振蕩消化，再用DMEM完全培養基終止消化，經過濾、離心后，棄上清液，加入4℃的PBS振蕩混勻，制成混合細胞懸液；