[發明專利]一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法

在審

• 申請號: 202010018273.4
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111117965A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 毛琦淇;張謝;仇騫慧;李宏
• 申請（專利權）人: 寧波市醫療中心李惠利醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 解敬文;施艷榮

1.一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、制備混合細胞懸液

取新鮮離體的腫瘤組織，剪碎，加入含膠原酶Ⅰ的DMEM不完全培養基，將混合液轉移到離心管中，振蕩消化腫瘤細胞，經離心后棄上清液；使用胰蛋白酶振蕩消化，再用DMEM完全培養基終止消化，經過濾、離心后，棄上清液，加入4℃的PBS振蕩混勻，制成所需混合細胞懸液；

步驟二、胎牛血清分離腫瘤細胞

取新離心管，加入胎牛血清，將步驟一得到的混合細胞懸液沿離心管壁緩慢加入到胎牛血清的上層，混合細胞懸液不能進入胎牛血清內，加完后放置到培養箱中靜置10-20min；

步驟三、時間差異消化純化腫瘤細胞

吸取步驟二離心管管底的細胞懸液，經離心后加入1640完全培養基，進行細胞培養，培養2-4天后吸走培養基，加入胰蛋白酶差異消化10-20s，吸走胰蛋白酶，離心吹打得到的沖洗液得到新的細胞懸液，繼續進行培養，獲得所需純化原代腫瘤細胞。

2.根據權利要求1所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，步驟一中，將接種人肺腺癌A549的荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，泡于75％酒精4-6min；在細胞間的超凈臺內用剪刀剪開裸鼠皮膚，在不出血情況下分離出腫瘤組織，離體的腫瘤組織浸泡于0.01MPBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg膠原酶Ⅰ的DMEM不完全培養基，吹散腫瘤組織，把混合液轉移到離心管中，使用振蕩器振蕩消化3-5min，然后放于37℃水浴鍋1-2min，循環10-15次，隨后離心，棄上清液，再加入15-20mL 0.01M PBS，振蕩混勻，離心，棄上清液，重復離心2-3次。

3.根據權利要求1所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，步驟一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振蕩器振蕩消化5-10min，加入30-40mL DMEM完全培養基終止消化，吹勻后將離心管中的液體倒入80目的篩子過濾，過濾后的液體轉移到新離心管中，離心，棄上清液，加入15-20mL 0.01M PBS，振蕩混勻，離心，棄上清液，重復3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01M PBS振蕩混勻，制成混合細胞懸液。

4.根據權利要求1或3所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，所述胰蛋白酶為：NaCl 0.08g、NaHCO₃ 0.005g、葡萄糖0.01g、EDTA 0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH₂O 10g。

5.根據權利要求1或3所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，所述DMEM完全培養基為：體積百分比10％的胎牛血清、體積百分比89％的DMEM不完全培養基和體積百分比1％的P/S。

6.根據權利要求1所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，步驟二中，取一新離心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步驟一得到的混合細胞懸液，將混合細胞懸液沿離心管壁緩慢加入到胎牛血清液體的上層，加完后放置到37℃培養箱中靜置10-20min。

7.根據權利要求1所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，步驟三中，吸取離心管管底的細胞懸液1-2mL，挪到新離心管中，加入15-20mL 0.01M PBS，振蕩混勻，離心，棄上清液，向離心管中加入1640完全培養基，吹打混勻，采用六孔板進行細胞培養，培養2-4天后吸走培養基，用0.01M PBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶消化10-20s，吸走胰蛋白酶，用0.01M PBS沖洗六孔板，得到沖洗液，離心沖洗液，對其中的細胞進行繼續培養，獲得純化后的原代腫瘤細胞。

8.根據權利要求1或7所述的一種高純原代腫瘤細胞的快速純化方法，其特征在于，所述1640完全培養基為：體積百分比10％的胎牛血清、體積百分比89％的1640不完全培養基和體積百分比1％的P/S。