[發(fā)明專利]沙門氏菌的快速恒溫檢測(cè)方法、引物組及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010017846.1
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111073985B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉偉;李雪玲;李園園;賈犇;韋朝春;陸長(zhǎng)德;李亦學(xué)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務(wù)所 31319
• 代理人: 夏思秋

本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)沙門氏菌的快速恒溫檢測(cè)方法、引物組及試劑盒。所述方法為：從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增沙門氏菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在沙門氏菌。本發(fā)明檢測(cè)方法具有高靈敏度和高特異性，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，操作便捷，成本低，具廣泛應(yīng)用前景。

本申請(qǐng)是2016年8月30日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?01610780485.X、發(fā)明名稱為：“快速恒溫檢測(cè)沙門氏菌的方法、引物及試劑盒”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測(cè)沙門氏菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)

沙門氏菌(Salmonella spp.)是一類革蘭氏染色陰性桿菌，主要棲息于人和動(dòng)物的腸道中，由糞便排出體外，并通過(guò)被污染的水和食物進(jìn)一步傳播，能引起人胃腸炎、傷寒和副傷寒等癥狀。近年來(lái)，沙門氏菌在全球范圍內(nèi)引起的危害呈不斷上升趨勢(shì)，是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要致病菌。因此，對(duì)于該菌的檢測(cè)和預(yù)防都具有重要意義。

傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)方法由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)于食源性致病菌檢測(cè)過(guò)程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來(lái)隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究人員陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)手段，但是這兩種方法都需要專門的檢測(cè)儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測(cè)部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進(jìn)行的實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。為了確保食品安全，急需快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)食品中的沙門氏菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見(jiàn)文獻(xiàn)Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測(cè)生物的公認(rèn)的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計(jì)的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說(shuō)，用戶首先必須確保該靶基因?yàn)榇郎y(cè)物種的特異序列。以發(fā)明專利ZL201110026963.5和ZL201110433262.3為例，它們分別針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的沙門氏菌的特異基因——fimY基因和invA基因，采用LAMP技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。然而，所謂“公認(rèn)的特異性基因”往往基于滯后的知識(shí)，并未基于不斷增長(zhǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實(shí)際應(yīng)用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的通用性不能確保的問(wèn)題。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的沙門氏菌檢測(cè)序列實(shí)際上并非沙門氏菌所共有，即，有可能漏檢沙門氏菌的部分菌株。類似的問(wèn)題也存在于特異性的確認(rèn)，即，有可能將非沙門氏菌錯(cuò)誤地認(rèn)定為沙門氏菌。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的沙門氏菌檢測(cè)方法，同時(shí)滿足基層檢測(cè)部門對(duì)快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部開(kāi)展實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容