[發(fā)明專利]利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法及制劑

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010014898.3
• 申請日: 2019-02-28
• 公開（公告）號: CN111154719A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高曉飛;黃彥杰;張清
• 申請（專利權(quán)）人: 西湖生物醫(yī)藥科技（杭州）有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32260
• 代理人: 張歡勇

本發(fā)明涉及一種利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法及制劑，特別涉及一種利用外周血中的Lin^?CD34^?細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞的方法，包括富集Lin^?CD34^?細(xì)胞，往紅系細(xì)胞分化Lin^?CD34^?細(xì)胞以及促進(jìn)紅細(xì)胞脫核成熟的步驟；另外還涉及利用所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞以及其中應(yīng)用的分化培養(yǎng)基以及細(xì)胞因子組合，該制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：原材料易得，紅細(xì)胞得率高，得到的紅細(xì)胞性能良好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞與細(xì)胞再生領(lǐng)域，特別涉及一種利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法及直接，還涉及利用所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞，以及單個核細(xì)胞用于制備成熟紅細(xì)胞的用途。

背景技術(shù)

眾多周知，輸血是治療嚴(yán)重缺血患者(例如：急性貧血、嚴(yán)重的血小板減少癥、血友病)的救命手段，但是目前在臨床醫(yī)學(xué)中存在很多的問題，主要體現(xiàn)在血液短缺以及輸血風(fēng)險(xiǎn)兩個方面。臨床用血短缺一直是全國乃至全球醫(yī)療健康領(lǐng)域存在的問題，據(jù)研究顯示，醫(yī)療臨床用血量每年以兩位數(shù)的比例逐年呈增長趨勢，而與此同時，合格獻(xiàn)血者數(shù)量在減少，再加上我國部分地方陸續(xù)取消互助獻(xiàn)血，導(dǎo)致了嚴(yán)重的血液供需矛盾-供不應(yīng)求；并且不容忽視的是，通過同種異體輸血的方式還存在血源傳播性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，由于血液存在“窗口期”，很多新型病原體在檢測期間是不會被檢測出來的，從而帶來了一定程度的輸血風(fēng)險(xiǎn)。另外輸血醫(yī)學(xué)還面臨著抗原/抗體不匹配導(dǎo)致患者發(fā)生免疫反抗以及稀有血型患者難以及時得到合適的血源的問題，以上種種用血問題引發(fā)了人們對臨床用血問題的關(guān)注，如何解決用血緊張的問題，成為了迫在眉睫的難題。

為了解決以上的用血問題，紅細(xì)胞再生技術(shù)迅猛地發(fā)展，目前所用的紅細(xì)胞再生方法主要是基于CD34⁺骨髓造血干細(xì)胞或CD34⁺臍帶血造血干細(xì)胞進(jìn)行的，該方案雖然也可以實(shí)現(xiàn)體外的紅系造血分化，但是提取CD34⁺骨髓造血干細(xì)胞會給細(xì)胞供應(yīng)者造成極大的身體痛苦和傷害，而CD34⁺臍帶血造血干細(xì)胞只有在新生兒出生的特定時間段能夠獲取，細(xì)胞取材困難，因此以上兩種方法在臨床應(yīng)用上存在極大的困難。

授權(quán)號為CN 103667188B的中國專利“一種制備成熟紅細(xì)胞的方法”中提到的了利用臍帶血或外周血中的單個核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)制備成熟紅細(xì)胞的方法，雖然該方法初步提到了從外周血中利用單個核細(xì)胞作為起始材料直接制備紅細(xì)胞的方法，但是該方法中存在的問題：其依舊是通過擴(kuò)增CD34⁺細(xì)胞的方式來獲取紅細(xì)胞，細(xì)胞獲取難度非常大，大規(guī)模臨床應(yīng)用可能性小。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法及制劑，具體而言，是利用外周血中少量的Lin^-CD34^-細(xì)胞體外分化培養(yǎng)大量紅細(xì)胞的方法，并建立穩(wěn)定的針對該細(xì)胞的紅系分化培養(yǎng)體系及條件，解決紅細(xì)胞體外分化這一重要難題。

本發(fā)明的第一方面提供一利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法及制劑，所述方法從外周血中分離得到單個核細(xì)胞，將單個核細(xì)胞和紅細(xì)胞及血小板等不同的細(xì)胞進(jìn)行初步分離，獲取并富集單個核細(xì)胞中的Lin^-CD34^-細(xì)胞，在紅系相關(guān)細(xì)胞因子充足的條件下誘導(dǎo)Lin^-CD34^-細(xì)胞向紅系分化并實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增，通過紅細(xì)胞脫核得到成熟的紅細(xì)胞。

本發(fā)明的第二方面提供一利用外周血體外制備成熟紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

步驟S1：從外周血中提取Lin^-CD34^-細(xì)胞；

步驟S2：富集Lin^-CD34^-細(xì)胞；

步驟S3：誘導(dǎo)所述Lin-CD34-細(xì)胞向紅系分化并進(jìn)行擴(kuò)增；以及