[發明專利]利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法及制劑

在審

• 申請號: 202010014898.3
• 申請日: 2019-02-28
• 公開（公告）號: CN111154719A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 高曉飛;黃彥杰;張清
• 申請（專利權）人: 西湖生物醫藥科技（杭州）有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 張歡勇

1.利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S1：從外周血中提取Lin^-CD34^-細胞；

步驟S2：富集Lin^-CD34^-細胞；

步驟S3：誘導所述Lin^-CD34^-細胞向紅系分化并進行擴增；以及

步驟S4：通過紅細胞脫核得到成熟的紅細胞。

2.根據權利要求1所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，在步驟S1中，利用添加牛血清白蛋白和EDTA的細胞分離緩沖液重懸細胞，添加生物素標記的抗體以及鏈霉親和素標記的磁珠，磁力作用下去除帶有特殊表面標志物的細胞，提取Lin-CD34^-細胞。

3.根據權利要求1或2任一所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，在步驟S2中，在第0-5天，將所述Lin^-CD34^-細胞接種干細胞擴增培養基中，并添加添加細胞因子組合以及青鏈霉素，富集Lin^-CD34^-細胞；在步驟S3中，將步驟S2得到的Lin^-CD34^-細胞接種到分化第一階段培養基，其中所述分化第一階段培養基內只提供向紅系發育相關的細胞因子，繼續培養9-11天，誘導Lin^-CD34^-細胞向紅系分化并擴增；在步驟S4中，將步驟S4中得到的Lin^-CD34^-細胞接種到分化第二階段培養基，其中所述分化第二階段培養基相對于所述分化第一階段培養基缺少部分細胞因子，繼續培養至7-9天，促進紅細胞脫核成熟。

4.根據權利要求3所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，所述細胞因子組合包括但不限于50-100ng/ml重組人類fms樣酪氨酸激酶3配體、50-100ng/ml重組人干細胞因子、50-100ng/ml重組人白細胞介素三、200-800pg/ml重組人白細胞介素六。

5.根據權利要求3所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，所述生物素標記的抗體包括但不限于生物素標記的鼠抗人CD3抗體、生物素標記的鼠抗人CD14抗體、生物素標記的鼠抗人CD16抗體、生物素標記的鼠抗人CD19抗體、生物素標記的鼠抗人CD41a抗體、生物素標記的鼠抗人CD56抗體和生物素標記的鼠抗人CD235a抗體。

6.根據權利要求3所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，所述分化第一階段培養基包括但不限于:IMDM，10-15％胎牛血清，5-10％人血漿，1-4mM谷氨酰胺，1-2％牛血清白蛋白，300-600μg/ml人轉鐵蛋白，8-13μg/ml重組人胰島素，2％青鏈霉素,3-5ng/ml重組人白細胞介素三，4-7U/ml重組人促紅細胞生成素以及100ng/ml重組人干細胞因子。

7.根據權利要求3所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法，其特征在于，所述分化第二階段培養基包括但不限于IMDM，15％胎牛血清，5-10％人血漿，1-4mM谷氨酰胺，1-2％牛血清白蛋白，300-600μg/ml人轉鐵蛋白，8-13μg/ml重組人胰島，2％青鏈霉素以及1-5U/ml重組人促紅細胞生成素。

8.根據權利要求1到3任一所述的利用外周血體外制備成熟紅細胞的方法制備得到的紅細胞。

9.用于富集Lin^-CD34^-細胞的細胞因子組合物，其特征在于，所述細胞因子組合物包括50-100ng/ml重組人類fms樣酪氨酸激酶3配體、50-100ng/ml重組人干細胞因子、50-100ng/ml重組人白細胞介素三、200-800pg/ml重組人白細胞介素六。

10.促進紅細胞誘導分化的分化階段培養基，其特征在于，所述分化階段培養基包括但不限于IMDM，10-15％胎牛血清，5-10％人血漿，1-4mM谷氨酰胺，1-2％牛血清白蛋白，300-600μg/ml人轉鐵蛋白，8-13μg/ml重組人胰島素，2％青鏈霉素以及重組人促紅細胞生成素。