[發明專利]番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ及侵染性克隆構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010014216.9
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111154731A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 李方方;龔攀;李浩;周雪平
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/34;C12N15/82;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 吳杰

本發明公開了一種番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV?BJ及侵染性克隆構建方法和應用，全基因組序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其保藏號為CGMCC NO.19119。將1.4個串聯重復的TYLCV?BJ基因組序列構建到pCambia2300載體上，獲得pCambia2300?TYLCV?BJ?1.4 DNA重組質粒；導入農桿菌EHA105中，獲得的農桿菌能夠成功侵染煙草和番茄植物。重組載體pCambia2300?TYLCV?BJ?1.4 DNA具有以下特征：1)具有侵染性，能夠成功侵染煙草、番茄和擬南芥植物；2)能夠在煙草、番茄和擬南芥植物上引起明顯的病毒癥狀，并積累病毒的DNA；3)通過突變病毒的基因，可用于研究病毒基因的功能；4)作為毒源，可用于篩選抗病毒的番茄品種及抗病毒的擬南芥突變體。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種番茄黃化曲葉病毒分離物及其侵染性克隆構建方法和應用。

背景技術

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow curl virus,TYLCV)是單鏈、環狀的植物DNA病毒，屬于雙生病毒科，菜豆金色花葉病毒屬。TYLCV能夠侵染茄科多種蔬菜作物與經濟作物，是我國及世界農業生產上重要的病原物。一般研究植物病毒的致病性和功能，需要首先獲得該病毒的侵染性克隆。

病毒的侵染性克隆是通過分子生物學的手段，利用基因工程技術體外構建具有侵染力的病毒。而已知的番茄黃化曲葉病毒TYLCV-SH2侵染力不強，不利于實驗開展。

發明內容

本發明的目的是提供一種番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ及侵染性克隆構建方法和應用。

本發明所述的番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ是本實驗室從北京溫室采集疑似番茄黃化曲葉病毒侵染的番茄樣品上分離的，其全基因組序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

將上述番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ導入到農桿菌，該菌株已經于2019年12月 9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，登記入冊編號保藏號CGMCC No.19119，分類命名為：土壤桿菌Agrobacterium sp.。保藏日期：2019年12月9日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ的侵染性克隆構建方法：將1.4個串聯重復的TYLCV-BJ基因組序列構建到pCambia2300載體上。

具體包括以下步驟：

(1)使用限制性內切酶EcoRI與BamHI酶切T-TYLCV-BJ-DNA，獲得約1.2kb的DNA 片段，大約為基因組的0.4拷貝；連接到EcoRI與BamHI酶切后的pCambia2300載體上；將重組載體pCambia2300-TYLCV-BJ-0.4轉化到大腸桿菌DH5a中，使用引物： TYLCV-BJ-EcoRI-F與TYLCV-BJ-BamH-R篩選陽性克隆；TYLCV-BJ-EcoRI-F與 TYLCV-BJ-BamH-R如SEQ ID：No.5-6所示；挑選陽性克隆，進行培養；提取培養目標克隆的質粒；通過DNA測序進行驗證；

TYLCV-BJ-EcoRI-F：GAATTCCTTGAAGTGCTTTAAATAATG

TYLCV-BJ-BamH-R：AAGTGGATCCCACATAGTGCAAGAC