[發明專利]番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ及侵染性克隆構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010014216.9
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111154731A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 李方方;龔攀;李浩;周雪平
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/34;C12N15/82;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 吳杰

1.一種番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ，其特征在于：全基因組序列如序列表中SEQID NO:2所示。

2.一種菌株，其含有權利要求1所述的番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ。

3.根據權利要求2所述的菌株，其保藏號為CGMCC NO.19119，保藏日期：2019年12月9日。

4.權利要求1所述番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ的侵染性克隆構建方法，其特征在于：將1.4個串聯重復的TYLCV-BJ基因組序列構建到pCambia2300載體上。

5.根據權利要求4所述的番茄黃化曲葉病毒分離物TYLCV-BJ侵染性克隆構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)使用限制性內切酶EcoRI與BamHI酶切T-TYLCV-BJ-DNA，獲得約1.2kb的DNA片段，大約為基因組的0.4拷貝；連接到EcoRI與BamHI酶切后的pCambia2300載體上；將重組載體pCambia2300-TYLCV-BJ-0.4轉化到大腸桿菌DH5a中，使用引物：

TYLCV-BJ-EcoRI-F與TYLCV-BJ-BamH-R篩選陽性克隆；TYLCV-BJ-EcoRI-F與TYLCV-BJ-BamH-R如SEQ ID：No.5-6所示；挑選陽性克隆，進行培養；提取培養目標克隆的質粒；通過DNA測序進行驗證；

TYLCV-BJ-EcoRI-F：GAATTCCTTGAAGTGCTTTAAATAATG

TYLCV-BJ-BamH-R：AAGTGGATCCCACATAGTGCAAGAC

(2)使用限制性內切酶BamHI酶切T-TYLCV-BJ-DNA，回收約2.7kb的DNA片段，為基因組的1個拷貝,；將BamHI酶切的2.7kb左右的DNA片段連接到BamHI酶切pCambia2300-TYLCV-BJ-0.4DNA載體上，將重組載體pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA轉化到大腸桿菌DH5a中，使用以下引物：TYLCV-BJ-FW-F與TYLCV-BJ-FW-R篩選陽性克隆；TYLCV-BJ-FW-F與TYLCV-BJ-FW-R如SEQ ID：No.7-8所示；挑選陽性克隆，進行培養；提取培養目標克隆的質粒；通過DNA測序進行驗證；驗證成功后，將其導入農桿菌EHA105菌株中；

TYLCV-BJ-FW-F：ACTGCCTGAATTGAGTGCC

TYLCV-BJ-FW-R：GTACCGGAAGCCCAGAATATAC。

6.權利要求5所述的構建方法獲得的pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA重組質粒。

7.權利要求6所述的重組載體pCambia2300-TYLCV-BJ-1.4DNA在分析TYLCV-BJ病毒的致病性、作為毒源篩選抗病毒的番茄品種及抗病毒的擬南芥突變體中的應用。