[發(fā)明專利]檢測新城疫病毒的引物和探針組合以及試劑盒和檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010013561.0 | 申請日： | 2020-01-07 |
| 公開（公告）號： | CN111118212A | 公開（公告）日： | 2020-05-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王春光;王文靜;張鐵;翟向和;李希明;曹立輝;白云;徐瑞濤 | 申請（專利權(quán)）人： | 河北農(nóng)業(yè)大學 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11 |
| 代理公司： | 石家莊國為知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 13120 | 代理人： | 陳曉彥 |
| 地址： | 071000 河北省保定市樂凱*** | 國省代碼： | 河北;13 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 檢測 新城 疫病 引物 探針 組合 以及 試劑盒 方法 | ||
本發(fā)明涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測新城疫病毒的引物和探針組合以及試劑盒和檢測方法。含有新城疫病毒RNA片段的待測物通過利用該引物和探針可通過反轉(zhuǎn)錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(shù)在等溫條件下進行大量擴增，操作簡單，所需時間短，特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測新城疫病毒的引物和探針組合以及試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)
新城疫(Newcastle Disease，ND)又名偽雞瘟，是由新城疫病毒(NDV)感染引起的以消化道和呼吸道為主要傳播途徑的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，傳播速度快，一年四季均可發(fā)病，對世界范圍內(nèi)的禽類養(yǎng)殖業(yè)危害極大。NDV主要感染禽類，一般雞最常見，雛雞最易感。患病雞臨床表現(xiàn)為體溫上升、呼吸急促、咳嗽、排黃綠色甚至灰白色水樣糞便，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降，軟殼蛋比例增加，即使恢復后也會對雞的生長發(fā)育有影響，因此給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。
ND的臨床癥狀與低致病性禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎等相似，都表現(xiàn)為呼吸困難，臨床診斷容易混淆。目前，國內(nèi)外已經(jīng)建立多種NDV檢測方法，血清學的方法包括血凝血抑試驗、瓊脂擴散試驗、中和試驗、免疫熒光試驗、免疫組化技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，分子生物學診斷方法包括：常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR(RFQ-PCR)、環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)等。其中，以PCR和RFQ-PCR是最常規(guī)的臨床檢測方法，但二者均需要昂貴的PCR儀，且所需的檢測時間較長，對操作人員有較高的技術(shù)要求。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有PCR和RFQ-PCR所需的檢測時間較長、對操作人員技術(shù)要求較高的問題，本發(fā)明提供了用于檢測新城疫病毒的引物和探針組合。
以及，本發(fā)明還提供了一種檢測新城疫病毒的試劑盒。
以及，本發(fā)明還提供了檢測新城疫病毒的方法。
為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例采用了如下的技術(shù)方案：
用于檢測新城疫病毒的引物和探針組合，所述引物的序列(如SEQ ID NO.1～2所示)為：
上游引物：5′-ACGTCTTTATTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGA-3′；
下游引物：5′-TGATTACCTAAGTCCTTTGCCAGAGCATCTACT-3′；
所述探針的序列(如SEQ ID NO.3所示)為：5′-AAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTA-THF-TGATGTATGCGGATA-3′。
含有新城疫病毒RNA片段的待測物利用上述引物可通過反轉(zhuǎn)錄重組酶介導等溫核酸擴增技術(shù)(RT-RAA)在等溫條件下進行大量擴增，不需對NDV模板反轉(zhuǎn)錄，操作簡單，在23min內(nèi)即可完成目的基因片段的擴增。其最低檢測限可達到100拷貝/μL，是常規(guī)PCR法(103拷貝/μL)靈敏度的10倍。同時對其他類癥禽病病原體核酸無交叉反應(yīng)，表現(xiàn)良好特異性。
其探針基于上述下游引物而設(shè)計，探針上距離5′端30bp位置有一個堿基缺口，并以四氫呋喃(THF)殘基修飾(SEQ ID NO.3中R即為THF)，當探針為單鏈時核酸內(nèi)切酶不識別，只有當探針和上述引物擴增所得的擴增產(chǎn)物中的目的片段結(jié)合后核酸內(nèi)切酶才開始工作，從而可提高該檢測方法的特異性，使其他病毒對檢測結(jié)果無干擾。
以及，本發(fā)明實施例還提供了一種檢測新城疫病毒的試劑盒，包含上述引物和探針組合。使用該試劑盒進行新城疫病毒的檢測對檢測設(shè)備和操作人員要求低，操作簡便，檢測成本低，并具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。
優(yōu)選地，所述探針5′端以熒光基團修飾，所述下游引物的5′端以生物素修飾，擴增完成后可通過側(cè)向流試紙條進行現(xiàn)場檢測，從而能夠簡便、快捷地診斷新城疫病毒。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于河北農(nóng)業(yè)大學，未經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/202010013561.0/2.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
