[發明專利]一種用于蘋果病毒病檢測的引物組、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202010013294.7
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111057794A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 徐世彥;梁建軍;梁彬
• 申請（專利權）人: 徐世彥;陜西新世界果業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 韓晶

本發明公開了一種用于蘋果病毒病檢測的引物組、試劑盒和檢測方法，涉及農業技術領域，所述檢測方法：提取脫毒試管苗總RNA，再反轉錄為cDNA；分別利用擴增ASLSV、ASGV、ASPV、ApMV及ASSVd病毒的引物對對cDNA進行PCR擴增，得到擴增產物；對擴增產物進行凝膠電泳，觀察電泳條帶；擴增產物中檢測到與病毒大小相應的擴增片段的為陽性；無相應擴增片段的為陰性。本發明采用RT?PCR法檢測蘋果病毒，優化反應程序，確定各病毒適宜的退火溫度，從而快速準確地檢測樣品是否攜帶病毒，檢測的準確率和正確率100％，準確率和靈敏度高，可用于規?；慕M培生產，為無病毒苗木的繁育提供技術支撐。

技術領域

本發明涉及農業技術領域，尤其涉及一種用于蘋果病毒病檢測的引物組、試劑盒和檢測方法。

背景技術

蘋果樹是多年生植物，在自然界的長期繁殖過程中，感染并積累了多種病毒。目前世界上報道的蘋果病毒病有39種，其中顯性病毒有25種，潛隱性病毒14種。我國現已鑒定明確的蘋果病毒病有6種，分別為蘋果銹果類病毒(ASSV)、蘋果花葉病毒(ApMv)、蘋果綠皺果病毒(AGrCV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)和蘋果莖溝病毒(ASGV)，其中前3種屬顯性病毒，后3種為潛隱性病毒。蘋果生產上規定只要脫除這六種病毒就可認為是無病毒。

非潛隱性的蘋果病毒病根據癥狀即可識別，而潛隱性病毒的鑒定需借助一定的技術和方法才能鑒定。針對蘋果銹果病毒(ASSVd)、蘋果花葉病毒(APMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)和蘋果莖痘病毒(ASPV)等幾種蘋果主要病毒，目前我國蘋果潛隱性病毒的檢測技術有血清學、木本指示植物法，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、分子雜交技術、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)等方法。

傳統技術常采用木本植物指示法和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)進行病毒檢測。木本指示植物法方法需時長而費工，酶聯免疫吸附測定法檢測技術具有較高靈敏度，但需要制備相應的抗血清，這就要求較高的設備條件和技術條件，加之蘋果潛隱性病毒在蘋果組織中的含量很低，而不少潛隱性病毒迄今尚未分離提純成功。

發明內容

有鑒于此，本發明實施例提供了一種用于蘋果病毒病檢測的引物組、試劑盒和檢測方法，主要目的是解決檢測效率和靈敏度低問題。

為達到上述目的，本發明主要提供了如下技術方案：

本發明提供了一種用于蘋果病毒病檢測的引物組，所述引物組包括分別擴增蘋果銹果類病毒、蘋果花葉病毒、蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖痘病毒和蘋果莖溝病毒的引物對；所述擴增蘋果褪綠葉斑病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述擴增蘋果莖溝病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述擴增蘋果莖痘病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述擴增蘋果花葉病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；所述擴增蘋果銹果類病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

本發明提供了一種用于蘋果病毒病檢測的試劑盒，所述試劑盒包括上述方案所述引物組。

本發明提供了一種蘋果病毒病的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：

1)提取脫毒試管苗總RNA，再反轉錄為cDNA；

2)利用權利要求1所述引物組對所述cDNA進行PCR擴增，得到擴增產物；

3)對擴增產物進行凝膠電泳，觀察電泳條帶；

若擴增產物中檢測到大小為331bp的擴增片段，則蘋果褪綠葉斑病毒檢測結果為陽性，若擴增產物中未檢測到大小為331bp的擴增片段，則蘋果褪綠葉斑病毒檢測結果為陰性；