[發(fā)明專利]一種用于蘋果病毒病檢測的引物組、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010013294.7
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111057794A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐世彥;梁建軍;梁彬
• 申請（專利權(quán)）人: 徐世彥;陜西新世界果業(yè)集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 韓晶

1.一種用于蘋果病毒病檢測的引物組，所述引物組包括分別擴增蘋果銹果類病毒、蘋果花葉病毒、蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖痘病毒和蘋果莖溝病毒的引物對；所述擴增蘋果褪綠葉斑病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述擴增蘋果莖溝病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述擴增蘋果莖痘病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；所述擴增蘋果花葉病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；所述擴增蘋果銹果類病毒的引物對的核苷酸序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10。

2.一種用于蘋果病毒病檢測的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述引物組。

3.一種蘋果病毒病的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

1)提取脫毒試管苗總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

2)利用權(quán)利要求1所述引物組對所述cDNA進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；

3)對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，觀察電泳條帶；

若擴增產(chǎn)物中檢測到大小為331bp的擴增片段，則蘋果褪綠葉斑病毒檢測結(jié)果為陽性，若擴增產(chǎn)物中未檢測到大小為331bp的擴增片段，則蘋果褪綠葉斑病毒檢測結(jié)果為陰性；

若擴增產(chǎn)物中檢測到大小為161bp的擴增片段，則蘋果花葉病毒檢測結(jié)果為陽性，若擴增產(chǎn)物中未檢測到大小為161bp的擴增片段，則蘋果花葉病毒檢測結(jié)果為陰性；

若擴增產(chǎn)物中檢測到大小為265bp的擴增片段，則蘋果莖痘病毒檢測結(jié)果為陽性，若擴增產(chǎn)物中未檢測到大小為265bp的擴增片段，則蘋果莖痘病毒檢測結(jié)果為陰性；

若擴增產(chǎn)物中檢測到大小為524bp的擴增片段，則蘋果莖溝病毒檢測結(jié)果為陽性，若擴增產(chǎn)物中未檢測到大小為524bp的擴增片段，則蘋果莖溝病毒檢測結(jié)果為陰性；

若擴增產(chǎn)物中檢測到大小為278bp的擴增片段，則蘋果銹果病毒檢測結(jié)果為陽性，若擴增產(chǎn)物中未檢測到大小為278bp的擴增片段，則蘋果銹果病毒檢測結(jié)果為陰性。

4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增體系以25μL計包括：cDNA2μL，NTP1μL，10*PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，引物對中的每個引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，用無菌雙蒸水補足25μL；所述引物對選自分別擴增ASLSV、ASGV、ASPV、ApMV及ASSVd病毒的引物對中的一種。

5.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為：

ACLSV的反應程序：94℃預變性5min；94℃1min、54℃30s、72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；

ASGV的反應程序：94℃預變性5min；94℃1min、58℃30s、72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；

ASPV的反應程序：94℃預變性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；

AMV的反應程序：94℃預變性5min；94℃1min、53℃30s、72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；

ASSVd的反應程序：94℃預變性5min；94℃1min、57℃30s、72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。